मॉडलिंग पैराक्रिन नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग इन विट्रो
Summary
वर्तमान अध्ययन विट्रो में पैराक्रिन नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और वापस लेने योग्य विधि को रेखांकित करता है। यह प्रोटोकॉल मुराइन न्यूरल क्रेस्ट कोशिकाओं और मायोब्लास्ट्स में पैराक्रिन डब्ल्यूएनटी 5 ए सिग्नलिंग के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया गया था।
Abstract
नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग इंट्रासेल्युलर एक्टिन फिलामेंट संगठन और भ्रूणजनन के दौरान पूर्वज कोशिकाओं के ध्रुवीकृत प्रवास को नियंत्रित करता है। इस प्रक्रिया में सिग्नल-भेजने और सिग्नल-रिसीविंग कोशिकाओं के बीच जटिल और समन्वित पैराक्रिन इंटरैक्शन की आवश्यकता होती है। यह देखते हुए कि ये इंटरैक्शन विभिन्न वंशों से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच हो सकते हैं, सेल-विशिष्ट दोषों का विवो मूल्यांकन चुनौतीपूर्ण हो सकता है। वर्तमान अध्ययन इन विट्रो में पैराक्रिन नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग का मूल्यांकन करने के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल को (1) किसी भी दो सेल प्रकार के हित के बीच नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग के कार्यात्मक और आणविक आकलन करने की क्षमता के साथ डिज़ाइन किया गया था; (2) नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग में सिग्नल-भेजने बनाम सिग्नल-प्राप्त अणुओं की भूमिका का विश्लेषण; और (3) मानक आणविक या फार्माकोलॉजिकल दृष्टिकोण के साथ फेनोटाइपिक बचाव प्रयोग करें।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग मायोब्लास्ट्स में न्यूरल क्रेस्ट सेल (एनसीसी) -मध्यस्थता नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। एनसीसी की उपस्थिति मायोब्लास्ट्स में फेलोइडिन-पॉजिटिव साइटोप्लाज्मिक फिलोपोडिया और लैमेलिपोडिया की बढ़ती संख्या से जुड़ी हुई है और घाव भरने वाली परख में मायोब्लास्ट माइग्रेशन में सुधार हुआ है। डब्ल्यूएनटी 5 ए-आरओआर 2 अक्ष को एनसीसी और दूसरे हृदय क्षेत्र (एसएचएफ) कार्डियोमायोब्लास्ट पूर्वजों के बीच एक महत्वपूर्ण नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग के रूप में पहचाना गया था। अंत में, यह विट्रो में पैराक्रिन नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अत्यधिक ट्रैक्टेबल प्रोटोकॉल है।
Introduction
नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग एक विकासवादी संरक्षित मार्ग है जो सेलुलर फिलामेंट संगठन और दिशात्मक प्रवास को नियंत्रित करता है। इस मार्ग को कई जैविक प्रक्रियाओं में फंसाया गया है, जिसमें भ्रूण ऊतक मोर्फोजेनेसिस 1,2,3, लसीका और संवहनी एंजियोजेनेसिस 4,5,6,7, और कैंसर की वृद्धि और मेटास्टेसिस 8,9,10 शामिल हैं . सेलुलर स्तर पर, सिग्नल-भेजने और सिग्नल-प्राप्त करने वाली कोशिकाओं के बीच समन्वित पैराक्रिन इंटरैक्शन के माध्यम से नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग की जाती है। ये इंटरैक्शन अक्सर विभिन्न वंशों या प्रकारों की कोशिकाओं के बीच होते हैं और इसमें एक विविध आणविक नेटवर्क शामिल होता है जिसमें 19 लिगेंड और कई रिसेप्टर्स, सह-रिसेप्टर्स और डाउनस्ट्रीम सिग्नल ट्रांसडक्शन प्रभावक11 शामिल होते हैं। इस सिग्नलिंग प्रक्रिया को और जटिल बनाते हुए, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि लिगैंड-रिसेप्टर संयोजन एक संदर्भ- और ऊतक-निर्भर तरीकेसे भिन्न हो सकते हैं 12,13, और सिग्नल-प्राप्त करने वाली कोशिकाओं में नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग चलाने वाले एक ही स्रोत लिगेंड को कई सिग्नल-सेंडिंग सेल प्रकार14,15 द्वारा उत्पादित किया जा सकता है। . नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग से जुड़ी सेलुलर और आणविक जटिलता को देखते हुए, विवो में व्यक्तिगत और चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक तंत्र का अध्ययन करने की क्षमता सीमित हो गई है।
विट्रो में सेल कल्चर तकनीकों का उपयोग करके नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग का अध्ययन करने के प्रयास किए गए हैं। उदाहरण के लिए, सेलुलर मोनोलेयर में किए गए घाव-उपचार परख का उपयोग सेलुलर दिशात्मकप्रवासन 4,16,17,18,19 का कार्यात्मक रूप से आकलन करने के लिए किया गया है। इम्यूनोस्टेनिंग तकनीकों का उपयोग सेलुलर आकृति विज्ञान 7,10, वास्तुकला और असममित ध्रुवीकरण 18,19,20 में गैर-कैननिकल डब्ल्यूएनटी-प्रेरित परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्थानिक विश्लेषण करने के लिए किया गया है। यद्यपि इन दृष्टिकोणों ने सिग्नल-प्राप्त कोशिकाओं में डब्ल्यूएनटी-संबंधित फेनोटाइप्स को चिह्नित करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान किए हैं, इन प्रोटोकॉल में सिग्नल भेजने वाले घटकों की कमी विवो में देखे गए पैराक्रिन सिग्नलिंग तंत्र को सटीक रूप से मॉडल करने की उनकी क्षमता को सीमित करती है। नतीजतन, इन विट्रो सिस्टम विकसित करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता बनी हुई है जो नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी मार्ग के सिग्नल-भेजने और प्राप्त करने वाली कोशिकाओं के बीच पैराक्रिन सिग्नलिंग इंटरैक्शन के मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मूल्यांकन की अनुमति देती है, विशेष रूप से विभिन्न सेल प्रकारों की।
इस अंत तक, इस अध्ययन का प्राथमिक उद्देश्य विट्रो में पैराक्रिन नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग इंटरैक्शन को मॉडल करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करना था। हमने एक गैर-संपर्क सह-संस्कृति प्रणाली विकसित की है जो इन इंटरैक्शन के सिग्नल-सेंडिंग और सिग्नल-रिसीविंग घटकों को पुन: व्यवस्थित करती है और गैर-कैननिकल डब्ल्यूएनटी मार्ग में विशिष्ट लिगैंड-रिसेप्टर तंत्र का स्वतंत्र रूप से अध्ययन करने के लिए मानक आणविक, आनुवंशिक या फार्माकोलॉजिकल दृष्टिकोण के उपयोग की अनुमति देती है। एनसीसी-मध्यस्थता वाले डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग के तंत्र की जांच स्थापित मुराइन सेल लाइनों का उपयोग करके मायोब्लास्ट्स में की गई थी। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, इस मॉडल का उपयोग चूहों में विवो अध्ययनों में पूर्व के निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए किया गया था जो डब्ल्यूएनटी 5 ए-आरओआर 2 अक्ष को एनसीएस 21 और एसएचएफ कार्डियोमायोब्लास्टपूर्वजों 3,22,23 के बीच एक प्रासंगिक नॉनकैनोनिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग के रूप में फंसाते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्लानर सेल पोलैरिटी (पीसीपी) सिग्नलिंग मार्ग एक गंभीर रूप से महत्वपूर्ण सेलुलर सिग्नलिंग मार्ग है जिसे कई विकासात्मक24,25 और रोग प्रक्रियाओं 24,26 में फंसाया गया है।<sup class=…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच पुरस्कार एफ 30एचएल 154324 द्वारा ओटी और के08एचएल 121191 और एसआरके को आर03एचएल 154301 द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक यह स्वीकार करना चाहते हैं कि इस पांडुलिपि में चित्रा 1 में योजनाबद्ध biorender.com के साथ बनाया गया था।
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
Referências
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
- Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
- Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
- Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. Biologia do Desenvolvimento. 381 (2), 365-376 (2013).
- Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
- Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
- Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
- Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
- Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
- Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
- Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
- Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
- Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
- Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
- Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
- Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
- Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
- Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
- Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
- Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, 12540 (2020).
- Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. Biologia do Desenvolvimento. 412 (1), 18-31 (2016).
- Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
- Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
- Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
- Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
- Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
- Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
- Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. Biologia do Desenvolvimento. 281 (1), 66-77 (2005).
- Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
- Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Martinotti, S., et al. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).
