Aqui, usamos a coloração vermelha de alizarina para mostrar que a exposição ao acetato de chumbo causa uma mudança na massa óssea nas larvas de peixe-zebra. Este método de coloração pode ser adaptado para a investigação da perda óssea em larvas de peixe-zebra induzida por outros tóxicos perigosos.
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Artigo de método
Usando coloração vermelha de alizarina para detectar perda óssea quimicamente induzida em larvas de peixe-zebra
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A perda óssea induzida quimicamente devido à exposição ao chumbo (Pb) pode desencadear uma série de impactos adversos nos sistemas esqueléticos humanos e animais. No entanto, os efeitos e mecanismos específicos no peixe-zebra permanecem obscuros. O vermelho de alizarina tem uma alta afinidade por íons de cálcio e pode ajudar a visualizar o osso e ilustrar a massa mineral esquelética. Neste estudo, nosso objetivo foi detectar a perda óssea induzida por acetato de chumbo (PbAc) em larvas de peixe-zebra utilizando a coloração vermelha de alizarina. Embriões de peixe-zebra foram tratados com uma série de concentrações de PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) entre 2 e 120 h após a fertilização. A coloração esquelética de montagem inteira foi realizada em larvas aos 9 dias após a fertilização, e a área total corada foi quantificada usando o software ImageJ. Os resultados indicaram que os tecidos mineralizados foram corados em vermelho, e a área corada diminuiu significativamente no grupo de exposição ao PbAc, com uma mudança dose-dependente na mineralização óssea. Este trabalho apresenta um protocolo de coloração para investigar alterações esqueléticas em defeitos ósseos induzidos por PbAc. O método também pode ser usado em larvas de peixe-zebra para a detecção de perda óssea induzida por outros produtos químicos.
Introdução
Estudos recentes têm confirmado que a osteoporose decorrente de glicocorticoides, inibidores da aromatase e consumo excessivo de álcool é comum 1,2. O chumbo (Pb) é um metal tóxico encontrado em plantas, solo e ambientes aquáticos3. Embora os efeitos adversos do Pb no corpo humano tenham atraído muita atenção, seu impacto irreversível no osso precisa ser investigado mais a fundo. A intoxicação por chumbo causa uma gama diversificada de alterações patológicas no esqueleto em desenvolvimento e no adulto, afetando as atividades normais da vida. Estudos encontraram associação entre exposiçã....
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Protocolo
Todos os procedimentos de animais descritos aqui foram revisados e aprovados pelo Instituto de Cuidados com Animais do Comitê de Ética da Universidade de Soochow.
1. Criação de peixes e colheita de embriões 14
- Alimentar os peixes três vezes por dia; Assegurar que o peixe-zebra é mantido a 28,5 ± 0,5 °C com um ciclo claro/escuro de 14:10 h.
- Separe os peixes adultos machos e fêmeas por placas de isolamento em tanques de desova em uma proporção de 2: 1 macho para fêmea à noite.
- Na manhã seguinte, retire as placas de isolamento às 9:00 da manhã e colete os embriões 2 h depoi....
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Resultados
A coloração vermelha de alizarina é um método sensível e específico para medir mudanças na mineralização óssea em larvas de peixe-zebra. Neste estudo, observamos que a PbAc teve efeitos adversos sobre as larvas de peixe-zebra, incluindo morte, malformação, diminuição da frequência cardíaca e encurtamento do comprimento corporal. Além disso, as áreas do esqueleto mineral de larvas de peixe-zebra foram avaliadas para examinar a perda óssea induzida por PbAc. A 9 dpf (Figura 1A), muitos ossos d.......
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Discussão
O peixe-zebra é um modelo adequado para o estudo da doença metabólica óssea. Em comparação com os modelos de roedores, os modelos de peixe-zebra são relativamente rápidos de estabelecer, e a medição da gravidade da doença é mais fácil. Em larvas de peixe-zebra do tipo selvagem, a mineralização do esqueleto da cabeça ocorre a 5 dpf e do esqueleto axial a 7 dpf15. Assim, ossos cranianos como PS, OP, CB e NC estão bem desenvolvidos a 9 dpf. Depois que as larvas foram completamente descoradas e branqu.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81872646; 81811540034; 81573173) e pelo Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu (PAPD).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH = 7,5) | Solarbio, Pequim, China | 21 | para deter |
| 4% de solução de fixação de paraformaldeído | BBI, Xangai, China | 14 | fixação de tecidos |
| 10x PBS buffer | BBI, Xangai, China | 15 | para fixação |
| de 35% H < sub > 2 < / sub> O2< / sub> | Yonghua, Jiangsu, China | 8 | removendo pigmento |
| Tubo de centrífuga de 50 mL | AKX, Jiangsu, China | 4 | |
| 95% de etanol anidro | Enox, Jiangsu, China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Pureza 99,5%) | Solarbio, Beijing, China | 1 | coloração |
| Incubadora bioquímica | Yiheng, Shanghai, China | 3 | criação de embriões de peixe-zebra |
| Balança eletrônica | Sartorius, Alemanha | 5 | pesando as matérias-primas sólidas |
| Glicerina (Pureza 99,5%) | BBI,Xangai,China | 7 | armazenando o peixe manchado |
| ImageJ (software) | EUA | 9 | análise digital |
| KOH (Pureza 99,9%) | Sigma,América | 10 | solução de branqueamento |
| Trihidrato de acetato de chumbo (Pureza 99,5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Pureza 99,9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | solução de limpeza |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japão | 13 | observando e tirando fotos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | remoção de embriões e |
| placas de solução (24 poços) | Corning,América | 17 | recipiente para coloração de placas de embriões |
| (6 poços) | Corning,América | recipiente 16 | para a criação de embriões |
| Agitando a tabela | Beyotime, China | 19 | que mistura a solução |
| Microscópio estereofónico | Nikon, Japão | 20 | que observa e que toma fotos |
| Zebrafish | Centro experimental do experimento do peixe-zebra da universidade de Soochow, Suzhou, China | 22 | animal experimental |
Referências
- Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
- Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbau....
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Reimpressões e permissões
