Indução de Infarto do Miocárdio e Lesão de Isquemia-Reperfusão Miocárdica em Camundongos

Summary

Descrevemos um método simples e reprodutível que pode induzir infarto do miocárdio ou lesão de isquemia-reperfusão miocárdica em camundongos por ligadura precisa da artéria coronária descendente anterior esquerda através de micromanipulação.

Abstract

O infarto agudo do miocárdio é uma doença cardiovascular comum e com alta mortalidade. A lesão de reperfusão miocárdica pode neutralizar os efeitos benéficos do refluxo cardíaco e induzir lesão miocárdica secundária. Um modelo simples e reprodutível de infarto do miocárdio e lesão de isquemia-reperfusão miocárdica é uma boa ferramenta para os pesquisadores. Aqui, um método personalizável para criar um modelo de infarto do miocárdio (IM) e MIRI por ligadura de precisão da artéria coronária descendente anterior (DA) por meio de micromanipulação é descrito. O posicionamento preciso e reprodutível da ligadura da DA ajuda a obter resultados consistentes para lesão cardíaca. As alterações no segmento ST podem ajudar a identificar a precisão do modelo. O nível sérico de troponina T cardíaca (cTnT) é usado para avaliar a lesão miocárdica, o ultrassom cardíaco é empregado para avaliar a função sistólica miocárdica e a coloração de Evans-Blue/cloreto de trifenil tetrazólio é usada para medir o tamanho do infarto. Em geral, esse protocolo reduz a duração do procedimento, garante o tamanho controlável do infarto e melhora a sobrevida do camundongo.

Introduction

O infarto agudo do miocárdio (IAM) é uma doença cardiovascular comum em todo o mundo e acarreta alta^mortalidade1. O avanço das tecnologias torna a revascularização precoce e eficaz disponível para pacientes com IAM. Após esses tratamentos, em alguns pacientes, pode ocorrer lesão de isquemia-reperfusão miocárdica (MIRI)². Assim, é de grande importância compreender os mecanismos de ações e como melhorar o MI/MIRI. Camundongos são amplamente utilizados como modelos devido ao seu baixo custo, rápido tempo de reprodução e facilidade para realizar alterações^{genéticas 3}. Estudiosos têm desenvolvido diferentes métodos para modelar MIRI e IM em animais 4,5,6,7,8,9. Essa estratégia favorece a pesquisa, mas os diferentes critérios e métodos empregados dificultam a interpretação dos resultados entre as equipes de pesquisa.

Em camundongos, o IM foi induzido por isoproterenol¹⁰, criolesão ^{11,12 ou} cauterização¹³. O IM pode ser induzido prontamente pelo isoproterenol, mas o processo fisiopatológico é diferente daquele do IM clínico. O IM induzido por cauterização é bem diferente do processo natural do infarto do miocárdio, e a reação inflamatória na área queimada é mais intensa; Além disso, a abordagem cirúrgica apresenta dificuldades técnicas. Além disso, existem alguns^{laboratórios14} desenvolvendo modelo de IM em miniporcos utilizando o método de bloqueio por balão ou embolização ou trombose através de técnica intervencionista. Todos esses métodos podem causar oclusão da artéria coronária diretamente, mas a necessidade de dispositivos de angiografia coronariana e, acima de tudo, das artérias coronárias de camundongo muito finas torna essas operações pouco práticas. Para a MIRI, as diferenças entre os diferentes modelos foram bastante modestas, como usar ou não respiradores/micromanipulação ^5,6.

Aqui é descrito um método simples e confiável que pode induzir IM e o modelo MIRI, adaptado de métodos previamente publicados4,5,6,7,8,9,15. Este método pode simular processos fisiopatológicos pelo bloqueio direto da DA através da ligadura. Além disso, ao aliviar a ligadura, esse modelo também pode simular lesão de reperfusão. Neste protocolo, um microscópio dissecante é utilizado para visualização da DAD. Em seguida, o pesquisador pode identificar prontamente a LAD. Posteriormente, a ligadura precisa da DAE leva à oclusão sanguínea reprodutível e previsível e isquemia ventricular. Além disso, alterações eletrocardiográficas (ECG) podem ser usadas para confirmar isquemia e reperfusão, além das mudanças de cor da DA observadas ao microscópio. Essa estratégia leva a uma menor duração do procedimento, menor risco de complicações cirúrgicas e menos camundongos experimentais necessários. Os métodos para o teste de troponina-T, ultrassom cardíaco e coloração de cloreto de trifenil tetrazólio (TTC) também são descritos. Em geral, este protocolo é útil para estudos do mecanismo MI/MIR, bem como para a descoberta de drogas.

Protocol

Os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Utilização de Animais da Universidade de Ciência e Tecnologia de Huazhong (Wuhan, China). NOTA: Camundongos C57BL/6J machos (8-10 semanas) são usados como modelos. Os camundongos têm livre acesso a comida e água e são criados em condições específicas livres de patógenos. A sala é mantida sob temperatura controlada (22 °C ± 2 °C) e umidade (45%-65%). Os ratos são expostos a um ambiente claro/escuro de 12 horas no C…

Representative Results

O fluxo de trabalho experimental é mostrado na Figura 1A. O pesquisador pode programar os nós de tempo de acordo com o desenho experimental no início do estudo. A duração da ligadura da DAE está de acordo com o objetivo da pesquisa. Para o IM, a pesquisa pode ignorar a etapa de reperfusão. A ultrassonografia cardíaca está disponível em diferentes estágios do estudo porque não é invasiva, enquanto a coloração Evans-Blue/TTC pode ser realizada apenas quando o camundongo é sacri…

Discussion

Nos últimos anos, a criação de modelos para IM e MIRI em pesquisas clínicas e científicas tem se desenvolvido rapidamente^20,21. No entanto, ainda existem algumas questões, como os mecanismos de ações e como melhorar o MI/MIRI, que devem ser resolvidas. Aqui, um protocolo modificado para estabelecer um modelo murino de IM e MIRI é descrito. Vários pontos-chave devem ser considerados com cuidado.

O primeiro ponto-chave é a int…

Materials

0.9 % sodium chloride solution	Kelun Industry Group,China		–
4% paraformaldehyde fixing solution	Servicebio,China	G1101	–
4-0 silk suture	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China	C412	–
8-0 suture	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China	H801	–
Buprenorphine	IsoReag,China	IR-11190	–
Camera	Canon,Japan	EOS 80D	–
Depilatory cream	Veet,French		–
Elecsys Troponin T hs STAT	Roche,Germany		–
Electrochemical luminescence immunoanalyzer	Roche,Germany	Elecsys 2010	–
Evans blue	Sigma,America	E2129	–
Eye scissors	Shanghai Medical Instruments,China	JC2303	–
Haemostatic forceps	Shanghai Medical Instruments,China	J31020	–
High frequency in vivo imaging systems	Visualsonics,Canada	Vevo2100	–
Ibuprofen	PerFeMiKer,China	CLS-12921	–
Intravenous catheter	Introcan,Germany	4254090B	–
Ketamine	Sigma-Aldrich,America	K2753	–
Medical alcohol	Huichang ,China		–
Microneedle holders	Shanghai Medical Instruments,China	WA2040	–
Microscopic shears	Shanghai Medical Instruments,China	WA1040	–
Microsurgical forceps	Shanghai Medical Instruments,China	WA3020	–
Mouse electrocardiograph	Techman,China	BL-420F	–
Needle holders	Shanghai Medical Instruments,China	JC3202	–
operating floor	Chico,China	ZK-HJPT	–
PE-10 tube	Huamei,China		–
Pentobarbital	Merck,America	1030001	–
Rodent Ventilator	Shanghai Alcott Biotech,China	ALC-V8S-P	–
Stereo microscope	Aomei Industry,China	SZM0745-STL3-T3	–
Surgical thermostatic heating pad	Globalebio, China	GE0-20W	–
Triphenyltetrazolium chloride	Servicebio,China	G1017	–
Xylazine	Huamaike Biochemicals and Life Science Research Prouducts,China	323004	–