Wir stellen eine Methode zur Bewertung der microRNA-Expression in Niere und Serum von Mäusen mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung durch quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion vor.
MicroRNAs (miRNAs) sind kleine, nicht-kodierende RNAs, die aus 21-25 Basen bestehen. Sie werden nicht in Proteine übersetzt, sondern behindern die Funktion ihrer Zielboten-RNAs (mRNAs), indem sie sie destabilisieren und ihre Translation stören. Obwohl die miRNA-Expressionsprofile in verschiedenen Mausorganen und -geweben untersucht wurden, gab es keine Standardmethoden zur Reinigung und Quantifizierung von Mausnieren- und Serum-miRNAs. Wir haben eine effektive und zuverlässige Methode zur Extraktion und Bewertung der miRNA-Expression im Serum und in der Niere von Mäusen mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung etabliert.
Die Methode verwendet die quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR), und das Protokoll erfordert sechs Schritte: (1) Vorbereitung von Seneszenz-beschleunigten Mauswiderstands-1 (SAMR1) Mäusen und Seneszenz-beschleunigten Maus-anfälligen (SAMP1) Mäusen; (2) Entnahme von Serumproben aus diesen Mäusen; (3) Entnahme einer Nierenprobe aus jeder Maus; (4) Extraktion der Gesamt-RNA (einschließlich miRNA) aus Nieren- und Serumproben jeder Maus; (5) die Synthese komplementärer DNA (cDNA) mit reverser Transkription aus der miRNA; (6) Durchführung einer qRT-PCR unter Verwendung der erhaltenen cDNA.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um zu bestätigen, dass im Vergleich zu den Kontrollen die Expression von miRNA-7218-5p und miRNA-7219-5p in der Niere und im Serum eines Mausmodells mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung signifikant verändert war. Dieses Protokoll klärte auch die Beziehung zwischen der Niere und dem Serum des Mausmodells der altersabhängigen Nierenfunktionsstörung. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die miRNA-Expression in der Niere und im Serum von Mäusen mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung zu bestimmen.
Es ist bekannt, dass die Expression verschiedener mRNAs, die sowohl in der Physiologie als auch in der Krankheit eine wichtige Rolle spielen (z. B. Entzündungen, Fibrose, Stoffwechselstörungen und Krebs), durch miRNAs reguliert wird, bei denen es sich um kurze, nicht-kodierende RNAs handelt, die den Abbau verursachen und die Transkription von mRNA1 hemmen. Es ist daher möglich, dass bestimmte miRNAs als neue Kandidatenbiomarker und/oder therapeutische Ziele für verschiedene Krankheitendienen könnten 2,3,4,5. Es wurden Untersuchungen zu miRNA-Expressionsprofilen in einer Vielzahl von Mausorganen und -geweben (einschließlich Gehirn6, Herz7, Lunge8, Leber9 und Niere10) durchgeführt. Es gibt jedoch keine Standard- oder etablierten Methoden zur Extraktion und Bewertung von miRNAs in den Nieren oder im Serum von Mäusen mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung.
Daher haben wir ein Protokoll etabliert, mit dem die miRNA-Expression im Serum und in der Niere von Mäusen mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung zuverlässig gereinigt und nachgewiesen werden kann. Es gibt sechs Hauptschritte im Protokoll: (1) Vorbereitung sowohl von 50 Wochen alten männlichen SAMR1-Mäusen als auch von männlichen SAMP1-Mäusen; (2) Entnahme von Blutproben aus der unteren Hohlvene beider Mäusestämme mit anschließender Verwendung eines Spitzröhrchens mit Heparin, gefolgt von Zentrifugation, um eine Serumprobe zu erhalten; (3) Nierenprobenextraktion aus den Mäusen – ein Siliziumhomogenisator wird verwendet, um die Nierenprobe separat zu homogenisieren, und die Probe wird dann in ein Biopolymer-Zerkleinerungssystem auf einer Mikrozentrifugenspinsäule11 überführt; (4) Gesamt-RNA-Extraktion (miRNA) aus den Serumproben unter Verwendung einer Siliciumdioxidmembran-basierten Spin-Säule12 und Gesamt-RNA-enthaltende miRNA-Extraktion aus den Nierenproben unter Verwendung einer Siliciumdioxidmembran-basierten Spin-Säule11; (5) Synthese komplementärer DNA (cDNA) aus der Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase, Poly(A)-Polymerase und Oligo-dT-Primer13,14; und (6) schließlich Bestimmung der miRNA-Expression mittels qRT-PCR und eines interkalierenden Farbstoffs13,14.
Dieses neue Protokoll basierte auf Studien, die es geschafft haben, miRNAs in verschiedenen Gewebearten zu extrahieren undzu bewerten 11,12,13. Es wurde gezeigt, dass das Biopolymer-Zerkleinerungssystem des Protokolls in der Lage ist, hochwertige Gesamt-RNA aus Gewebenzu reinigen 11. Die Genauigkeit und Sensitivität von Aspekten dieses Protokolls, die für die Bewertung der miRNA-Expression mittels qRT-PCR mit einem interkalierenden Farbstoff verwendet werden, wurden13,14 nachgewiesen, beispielsweise die cDNA-Synthese mit reverser Transkriptase, Poly(A)-Polymerase und Oligo-dT-Primern aus der extrahierten Gesamt-RNA. Das neue Protokoll hat mehrere Vorteile: Einfachheit, Zeitersparnis und reduzierte technische Fehler. Es kann daher für Untersuchungen verwendet werden, die eine genaue und sensitive Identifizierung von Nieren- und Serum-miRNA-Profilen erfordern. Studien zu vielen pathologischen Zuständen können auch das neue Protokoll verwenden.
Die miRNA-Expressionsprofile in SAMP1-Mäusen, die ein Modell für eine altersabhängige Nierenfunktionsstörung darstellen, können wie unten gezeigt bestimmt werden. Beim Menschen ist eine altersabhängige Nierenfunktionsstörung mit dem Fortschreiten der Niereninsuffizienz assoziiert und sowohl durch eine Zunahme des Bereichs der renalen interstitiellen Fibrose als auch durch das Fortschreiten der Glomerulosklerose gekennzeichnet15,16. Die altersabhängige Nierenfunktionsstörung ist auch ein wichtiges und häufiges Merkmal chronischer Nierenerkrankungen und terminaler Niereninsuffizienz15,16.
Die Expressionsniveaus der Ziel-miRNAs wurden erfolgreich durch das oben beschriebene Protokoll mittels qRT-PCR bestimmt. Die Auswertung der extrahierten miRNAs ist ein wichtiger Schritt, um aussagekräftige qRT-PCR-Daten zu erhalten. Um die adäquate Qualität der miRNAs vor der Durchführung der qRT-PCR zu bestätigen, sollte mittels Spektrophotometrie das Verhältnis der Absorption bei 260 nm zu der bei 280 nm bestimmt werden. DNA-Verunreinigungen können auftreten, und/oder Primer-Dimere in jeder Vertiefung der Reaktionsplatte können vorhanden sein, wenn die qRT-PCR keine einzige PCR-Amplifikation der erwarteten Länge und Schmelztemperatur liefert oder wenn sie eine monomodale Schmelzkurve liefert.
MiRNA-Expressionsniveaus können mit verschiedenen Methoden als qRT-PCR bewertet werden, einschließlich Northern Blotting, einem Microarray und Ribonuklease-Schutzassays. Die qRT-PCR-Methode ist jedoch ein empfindliches, genaues, einfaches und reproduzierbares Verfahren, das ein kleineres Probenvolumen erfordert als für Northern Blotting und Ribonuklease-Schutzassays19. Da Microarrays die Expression von Zehntausenden von miRNAs gleichzeitig messen können, können sie verwendet werden, um miRNA-Markerkandidaten zu identifizieren. Microarray-Daten zeigen auch eine hohe Gesamtkorrelation mit Daten, die mit qRT-PCR20 gewonnen wurden. Es wurde jedoch kein Konsens über die optimale Methodik für den Vergleich von Microarray-Daten erzielt, die in verschiedenen Studien gewonnen wurden21.
Die Auswertung von Serum-miRNAs weist folgende Merkmale auf. Erstens ist es einfach, Serum zu sammeln, und da Serum-miRNAs stabil gegen Einfrieren und Auftauen, Temperatur und Säure sind, können die miRNAs gute Biomarker sein. Zweitens gibt es eine hohe Homologie von miRNAs zwischen den Arten, und die Ergebnisse von Tierversuchen lassen sich leicht auf den Menschen übertragen. Drittens haben Serum-miRNAs Potenzial für den Einsatz als therapeutische Medikamente gezeigt3. Mehrere Studien haben auch gezeigt, dass der Grad der Expression von miRNA in Organen mit miRNA im Serumkorreliert ist 22,23,24. In der vorliegenden Studie zeigte miRNA-223-3p, deren Nierenspiegel keinen signifikanten Unterschied zwischen den SAMR1- und SAMP1-Mäusen zeigten, ebenfalls keinen signifikanten Unterschied zwischen den Stämmen im Serum. Im Gegensatz dazu zeigten miRNA-7218-5p und miRNA-7219-5p, deren Nierenspiegel einen signifikanten Unterschied zwischen den SAMR1- und SAMP1-Mäusen zeigten, erhebliche Unterschiede zwischen den Stämmen im Serum.
Für dieses Protokoll gelten die folgenden Einschränkungen. Erstens wurde seine Nützlichkeit in anderen Organen wie Leber und Lunge nicht nachgewiesen, und zweitens wurde es nicht an anderen Labortieren wie Ratten, Hunden und Schweinen getestet. Mehrere Forschungsgruppen haben dieses Protokoll für die Aufreinigung und den Nachweis von miRNAs mittels qRT-PCR verwendet und berichtet, dass dieses Protokoll die Reinigung von hochwertiger RNA aus Geweben und Serumermöglicht 13,14,22,23,24. Diese Methode hat nachweislich eine hohe Genauigkeit und Empfindlichkeit zum Nachweis der Expression von miRNAs 13,14,22,23,24. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass dieses Protokoll die miRNA-Expression im Serum und in der Niere von Mäusen erfolgreich nachweisen kann. Daher kann das Protokoll verwendet werden, um die Serum- und Nieren-miRNA-Expressionsprofile bei Mäusen mit einer Vielzahl von Pathologien zu bestimmen. Aufgrund der Einfachheit des Protokolls kann eine große Anzahl von Proben gleichzeitig verarbeitet werden. Analysen der Expression vieler miRNAs bei verschiedenen pathologischen Zuständen der Niere können daher das hierin beschriebene Protokoll verwenden.
Es gibt bestimmte Aspekte des Protokolls zu beachten. Um den Abbau der gereinigten miRNAs zu vermeiden, der bei Raumtemperatur auftreten würde, müssen die miRNAs auf Eis gehalten werden. Die Nierenproben müssen homogenisiert werden, bis sie vollständig im Lysereagenz gelöst sind. Mausniere enthält eine beträchtliche Menge an Bindegewebe, das in Lysereagenz unlöslich ist, und daher ist ein Säulenschredder für die weitere Homogenisierung erforderlich. Darüber hinaus sollte die geeignete endogene Kontroll-miRNA (mit stabiler Expression unter den Proben) während des Aufbaus eines qRT-PCR-Experiments validiert werden. Dies liegt daran, dass die Interferenz verschiedener Substanzen während der Durchführung dieses Protokolls die Expressionsniveaus endogener Kontroll-miRNAs verändern kann, was möglicherweise die Ergebnisse beeinträchtigt. Zusammenfassend beschreibt dieser Artikel ein qRT-PCR-Protokoll zum Nachweis, zur Aufreinigung und Bewertung der miRNA-Expression im Serum und in der Niere von Mäusen mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung.
The authors have nothing to disclose.
Nichts.
1.0 mL spitz with heparin | Greiner-bio-one | 450534 | |
Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4) | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2) | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00003871 | 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU G-3' |
miRNA-423-5p primer | Qiagen | MS00012005 | 5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU UU-3' |
miRNA-7218-5p primer | Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG -3' |
miRNA-7219-5p primer | Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA GA-3' |
miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
miRNeasy Serum/Plasma kit | Qiagen | 217184 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
miScript II RT kit (reverse transcription buffer) | Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit |
miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit |
QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube |
QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent) | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not disclosed due to confidentiality |
SAMP1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
SAMR1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
Takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer |