الإصابات شبه الآلية التي يسببها الليزر لدراسة تجديد الحبل الشوكي في يرقات أسماك الزرد
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة للحث على إصابات خاصة بالأنسجة وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة في يرقات أسماك الزرد باستخدام نظام آفة ليزر مقترن بمنصة ميكروفلويديك آلية للتعامل مع اليرقات.
Abstract
تمتلك يرقات الزرد جهازا عصبيا مركزيا يعمل بكامل طاقته (CNS) مع قدرة تجديدية عالية بعد أيام قليلة فقط من الإخصاب. هذا يجعل هذا النموذج الحيواني مفيدا جدا لدراسة إصابة الحبل الشوكي وتجديده. البروتوكول القياسي لتحفيز مثل هذه الآفات هو عبور الجزء الظهري من الجذع يدويا. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنية تدريبا مكثفا وتلحق الضرر بأنسجة إضافية. تم تطوير بروتوكول للآفات الناجمة عن الليزر للتحايل على هذه القيود ، مما يسمح بقابلية عالية للتكاثر واكتمال انتقال الحبل الشوكي على العديد من الحيوانات وبين الجلسات المختلفة ، حتى بالنسبة لمشغل غير مدرب. علاوة على ذلك ، يقتصر تلف الأنسجة بشكل أساسي على الحبل الشوكي نفسه ، مما يقلل من الآثار المربكة الناجمة عن إصابة الأنسجة المختلفة ، على سبيل المثال ، الجلد والعضلات والجهاز العصبي المركزي. علاوة على ذلك ، من الممكن حدوث آفات نصف في الحبل الشوكي. إن تحسين الحفاظ على سلامة الأنسجة بعد إصابة الليزر يسهل إجراء المزيد من التشريحات اللازمة لإجراء تحليلات إضافية، مثل الفيزيولوجيا الكهربية. وبالتالي ، توفر هذه الطريقة تحكما دقيقا في مدى الإصابة الذي لا يمكن تحقيقه يدويا. وهذا يسمح بنماذج تجريبية جديدة في هذا النموذج القوي في المستقبل.
Introduction
على النقيض من الثدييات، يمكن لسمك الزرد (دانيو ريريو) إصلاح الجهاز العصبي المركزي (CNS) بعد الإصابة1. استخدام يرقات الزرد كنموذج لتجديد الحبل الشوكي حديث نسبيا. وقد ثبت أنه من المفيد التحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء الإصلاح2. ويرجع ذلك إلى سهولة التلاعب ، والدورة التجريبية القصيرة (يرقات جديدة كل أسبوع) ، والشفافية البصرية للأنسجة ، وصغر حجم اليرقات ، وهي مناسبة بشكل مثالي للفحص المجهري الفلوري في الجسم الحي .
في حالة تجديد الحبل الشوكي ، هناك ميزتان إضافيتان لاستخدام اليرقات هما سرعة الشفاء ، بضعة أيام مقارنة ببضعة أسابيع للبالغين ، وسهولة إحداث إصابات باستخدام التقنيات اليدوية. وقد استخدم هذا بنجاح في العديد من الدراسات3،4،5، بما في ذلك التحقيقات الأخيرة6،7. بشكل عام ، يؤدي هذا إلى زيادة إنتاج البيانات ذات المغزى ، والقدرة العالية على التكيف مع البروتوكولات التجريبية ، وانخفاض التكاليف التجريبية. كما أن استخدام اليرقات التي يقل عمرها عن 5 أيام بعد الإخصاب يقلل أيضا من استخدام الحيوانات التي تتبع مبادئ 3R في البحوث على الحيوانات8.
بعد إصابة الحبل الشوكي في يرقات الزرد ، تحدث العديد من العمليات البيولوجية ، بما في ذلك الاستجابة الالتهابية ، وانتشار الخلايا ، وتكوين الخلايا العصبية ، وهجرة الخلايا الباقية أو المتولدة حديثا ، وإصلاح المحاور الوظيفية ، وإعادة تشكيل عالمي لدوائر العمليات العصبية وأنسجة العمود الفقري6،7،9،10 . ولكي يتم تنسيق هذه العمليات بنجاح، فإنها تنطوي على تفاعل منظم بدقة بين مجموعة من أنواع الخلايا، ومكونات المصفوفة خارج الخلية، والإشارات الكيميائية الحيوية11،12. إن الكشف عن تفاصيل إعادة التنظيم الكبيرة هذه لنسيج معقد مثل الحبل الشوكي يتطلب استخدام وتطوير مناهج تجريبية دقيقة وخاضعة للرقابة.
النموذج التجريبي الأساسي المستخدم لدراسة تجديد الحبل الشوكي في أسماك الزرد هو استخدام الوسائل الجراحية للحث على تلف الأنسجة عن طريق الاستئصال أو الطعن أو الإصابة بالتبريد3,13. ومن عيوب هذه النهج أنها تتطلب تدريبا محددا على مهارات الجراحة المجهرية، وهو أمر يستغرق وقتا طويلا لأي مشغل جديد وقد يمنع استخدامها في مشاريع قصيرة الأجل. علاوة على ذلك ، فإنها عادة ما تحفز تلف الأنسجة المحيطة ، مما قد يؤثر على التجديد.
وهناك نهج آخر يتمثل في الحث على تلف الخلايا كيميائيا14 أو عن طريق التلاعب الجيني15. هذا الأخير يسمح بأضرار مستهدفة للغاية. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنية عملا تحضيريا طويلا لتوليد أسماك معدلة وراثيا جديدة قبل إجراء أي تجربة ، يتم تجديدها في كل مرة يتم فيها استهداف نوع خلية فريد.
وبالتالي ، هناك حاجة إلى طريقة تسمح بالآفات المستهدفة ولكن متعددة الاستخدامات المناسبة لمجموعة متنوعة من الدراسات في التجديد. الحل هو استخدام الليزر للحث على تلف موضعي في الأنسجة ذات الاهتمام16،17،18،19،20. في الواقع ، يمثل استخدام تلف الأنسجة الناجم عن الليزر نهجا قويا لتوليد آفات الحبل الشوكي مع العديد من المزايا. تسمح المجاهر المجهزة بوحدات معالجة الليزر هذه بتحديد منطقة مخصصة الشكل حيث سيحدث استئصال الخلايا ، مع فائدة إضافية تتمثل في التحكم الزمني. وبالتالي يمكن تكييف حجم وموضع الآفة لمعالجة أي أسئلة.
السمة المفقودة لمعظم أنظمة آفات الليزر هي إمكانية إحداث إصابات بطريقة قابلة للتكرار بشكل كبير لسلسلة من اليرقات. هنا يتم وصف بروتوكول أصلي باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية للحث على آفات دقيقة ومضبوطة شبه آلية في يرقات أسماك الزرد استنادا إلى منصة ميكروفلويديك مصممة للتعامل الآلي مع اليرقات21. علاوة على ذلك ، في النظام المعروض هنا ، يتم إدخال اليرقات في الشعيرات الدموية الزجاجية ، مما يسمح بالدوران الحر للحيوان حول محوره الوردي. يمكن للمستخدم اختيار أي جانب من اليرقة لتقديمه إلى الليزر مع السماح للتصوير الفلوري باستهداف شعاع الليزر بدقة وتقييم الضرر بعد الآفة.
يستخدم البروتوكول الموصوف هنا مع نظام تصوير يرقات الزرد شبه الآلي جنبا إلى جنب مع قرص دوار مجهز بليزر الأشعة فوق البنفسجية (المسمى فيما يلي باسم نظام VAST ). ومع ذلك ، فإن النقاط الرئيسية للبروتوكول ومعظم ادعاءات هذه التقنية صالحة لأي نظام مجهز بالليزر قادر على استئصال الخلايا ، بما في ذلك المجاهر الضوئية بالليزر ثنائي الفوتون ، أو المجاهر ذات القرص الدوار المزودة بليزر الأشعة فوق البنفسجية (وحدة FRAP) ، أو مجاهر الفيديو مع وحدة ليزر لمعالجة الصور. سيكون أحد الاختلافات الرئيسية بين نظام VAST ومعالجة العينات التقليدية هو أنه بالنسبة لهذا الأخير ، ستكون هناك حاجة إلى تركيب يرقات في أغاروز منخفض درجة الانصهار على أغطية زجاجية / أطباق بتري ذات قاع زجاجي بدلا من تحميلها في طبق من 96 بئرا.
الفوائد التي توفرها هذه الطريقة تفتح فرصا للبحث المبتكر حول الآليات الخلوية والجزيئية أثناء عملية التجديد. علاوة على ذلك ، تسمح جودة البيانات العالية بإجراء تحقيقات كمية في سياق متعدد التخصصات.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك حاجة ملحة لفهم أعمق للعمليات التي تلعب دورا أثناء التجديد في أسماك الزرد. يقدم هذا النموذج الحيواني العديد من الفوائد للبحوث الطبية الحيوية، وخاصة لإصابات الحبل الشوكي1. تتضمن معظم الدراسات آفات يدوية تتطلب مشغلا مدربا تدريبا جيدا وتحفز على تلف الأنسجة المتعددة. يتم تقد…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل BBSRC (BB / S0001778/1). يتم تمويل CR من قبل برنامج الأميرة رويال تينوفوس اسكتلندا للمنح الدراسية للبحوث الطبية. نشكر ديفيد غرينالد (CRH ، جامعة إدنبرة) وكاتي ريد (CDBS ، جامعة إدنبرة) على الهدية اللطيفة للأسماك المعدلة وراثيا (انظر الملف التكميلي). نشكر دانيال سونغ (CRH ، جامعة إدنبرة) على الوصول الكريم إلى قرص الغزل 3i confocal.
Materials
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
Referências
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
- Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
- Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
- Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
- . National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research Available from: https://nc3rs.org.uk (2021)
- Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
- Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
- Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
- Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
- Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
- Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
- Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
- Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- . AndOr Micropoint Manual Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021)
- Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
- Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Howell, D. . Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).
- Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
- Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
