Het huidige protocol beschrijft een methode om weefselspecifieke en zeer reproduceerbare verwondingen bij zebravislarven te induceren met behulp van een laserlaesiesysteem in combinatie met een geautomatiseerd microfluïdisch platform voor het hanteren van larven.
Zebravislarven bezitten slechts enkele dagen na de bevruchting een volledig functioneel centraal zenuwstelsel (CZS) met een hoog regeneratief vermogen. Dit maakt dit diermodel zeer nuttig voor het bestuderen van dwarslaesie en regeneratie. Het standaardprotocol voor het induceren van dergelijke laesies is om het dorsale deel van de romp handmatig te transecteren. Deze techniek vereist echter uitgebreide training en beschadigt extra weefsels. Er werd een protocol ontwikkeld voor lasergeïnduceerde laesies om deze beperkingen te omzeilen, waardoor een hoge reproduceerbaarheid en volledigheid van de dwarsdoorsnede van het ruggenmerg over veel dieren en tussen verschillende sessies mogelijk is, zelfs voor een ongetrainde operator. Bovendien is weefselschade voornamelijk beperkt tot het ruggenmerg zelf, waardoor verstorende effecten van het verwonden van verschillende weefsels, bijvoorbeeld huid, spieren en CZS, worden verminderd. Bovendien zijn hemi-laesies van het ruggenmerg mogelijk. Verbeterd behoud van weefselintegriteit na laserletsel vergemakkelijkt verdere dissecties die nodig zijn voor aanvullende analyses, zoals elektrofysiologie. Daarom biedt deze methode een nauwkeurige controle van de letselomvang die handmatig onhaalbaar is. Dit maakt nieuwe experimentele paradigma’s in dit krachtige model in de toekomst mogelijk.
In tegenstelling tot zoogdieren kunnen zebravissen (Danio rerio) hun centrale zenuwstelsel (CZS) herstellen na een verwonding1. Het gebruik van zebravislarven als model voor regeneratie van het ruggenmerg is relatief recent. Het is waardevol gebleken om de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan reparatie2 te onderzoeken. Dit komt door het gemak van manipulatie, de korte experimentele cyclus (elke week nieuwe larven), de optische transparantie van de weefsels en de kleine omvang van de larven, bij uitstek geschikt voor in vivo fluorescentiemicroscopie.
In het geval van regeneratie van het ruggenmerg zijn twee extra voordelen van het gebruik van larven de snelheid van herstel, een paar dagen in vergelijking met een paar weken voor volwassenen, en het gemak van het induceren van verwondingen met behulp van handmatige technieken. Dit is met succes gebruikt in vele studies3,4,5, waaronder recente onderzoeken6,7. Over het algemeen leidt dit tot een verhoogde zinvolle gegevensproductie, een hoog aanpassingsvermogen van experimentele protocollen en lagere experimentele kosten. Het gebruik van larven jonger dan 5 dagen na de bevruchting vermindert ook het gebruik van dieren volgens de 3R-principes in dieronderzoek8.
Na een dwarslaesie bij zebravislarven treden veel biologische processen op, waaronder ontstekingsreactie, celproliferatie, neurogenese, migratie van overlevende of nieuw gegenereerde cellen, reformatie van functionele axonen en een wereldwijde remodellering van neurale processen circuits en wervelkolomweefsels6,7,9,10 . Om met succes te worden georkestreerd, omvatten deze processen een fijn gereguleerde interactie tussen een reeks celtypen, extracellulaire matrixcomponenten en biochemische signalen11,12. Het ontrafelen van de details van deze belangrijke reorganisatie van een complex weefsel zoals het ruggenmerg vereist het gebruik en de ontwikkeling van nauwkeurige en gecontroleerde experimentele benaderingen.
Het primaire experimentele paradigma dat wordt gebruikt om spinale regeneratie bij zebravissen te bestuderen, is het gebruik van chirurgische middelen om weefselschade te induceren door resectie, steken of cryo-letsel3,13. Deze benaderingen hebben het nadeel dat specifieke training in microchirurgische vaardigheden vereist is, wat tijdrovend is voor elke nieuwe operator en het gebruik ervan in kortetermijnprojecten kan voorkomen. Bovendien veroorzaken ze meestal schade aan de omliggende weefsels, wat de regeneratie kan beïnvloeden.
Een andere benadering is om celbeschadiging chemisch te induceren14 of door genetische manipulaties15. Dit laatste zorgt voor zeer gerichte schade. Een dergelijke techniek vereist echter lang voorbereidend werk om nieuwe transgene vissen te genereren voordat een experiment wordt uitgevoerd, vernieuwd telkens wanneer een uniek celtype wordt gericht.
Er is dus behoefte aan een methode die gerichte maar veelzijdige laesies mogelijk maakt die geschikt zijn voor een verscheidenheid aan onderzoeken naar regeneratie. Een oplossing is om een laser te gebruiken om gelokaliseerde schade in het weefsel van belang te induceren16,17,18,19,20. Inderdaad, het gebruik van laser-geïnduceerde weefselschade biedt een robuuste aanpak voor het genereren van ruggenmerglaesies met veel voordelen. De microscopen uitgerust met dergelijke lasermanipulatiemodules maken het mogelijk om een aangepast gevormd gebied te specificeren waar celablatie zal plaatsvinden, met het extra voordeel van temporele controle. De grootte en positie van de laesie kunnen zo worden aangepast om eventuele vragen te beantwoorden.
Het ontbrekende kenmerk van de meeste laserlaesiesystemen is de mogelijkheid om verwondingen op een zeer reproduceerbare manier te induceren voor een reeks larven. Hier wordt een origineel protocol beschreven met behulp van een UV-laser om semi-geautomatiseerde precieze en gecontroleerde laesies in zebravislarven te induceren op basis van een microfluïdisch platform dat is ontworpen voor geautomatiseerde larvenverwerking21. Bovendien worden larven in het hier gepresenteerde systeem ingebracht in een glazen capillair, waardoor het dier vrij rond zijn rostrocaudale as kan draaien. De gebruiker kan kiezen welke kant van de larve aan de laser wordt gepresenteerd, terwijl fluorescentiebeeldvorming de laserstraal nauwkeurig kan richten en de schade na de laesie kan beoordelen.
Het hier beschreven protocol wordt gebruikt met een semi-geautomatiseerd zebravislarve beeldvormingssysteem in combinatie met een draaiende schijf uitgerust met een UV-laser (hierna aangeduid als het VAST-systeem). De belangrijkste punten van het protocol en de meeste claims van de techniek zijn echter geldig voor elk systeem dat is uitgerust met een laser die in staat is tot celablatie, inclusief laserscanmicroscopen met twee fotonen, spinning-disk microscopen voorzien van een UV-laser (FRAP-module) of videomicroscopen met een lasermodule voor fotomanipulatie. Een van de belangrijkste verschillen tussen het VAST-systeem en de conventionele monsterbehandeling zal zijn dat voor de laatste, het monteren van larven in agarose met een laag smeltpunt op glazen afdekkingsplaten / petrischalen met glazen bodem in plaats van ze in een 96-putplaat te laden, vereist is.
De voordelen van deze methode bieden kansen voor innovatief onderzoek naar de cellulaire en moleculaire mechanismen tijdens het regeneratieproces. Bovendien maakt de hoge datakwaliteit kwantitatief onderzoek in een multidisciplinaire context mogelijk.
Er is dringend behoefte aan een dieper begrip van de processen die spelen tijdens regeneratie bij zebravissen. Dit diermodel biedt veel voordelen voor biomedisch onderzoek, in het bijzonder voor ruggenmergletsels1. De meeste studies hebben betrekking op handmatige laesies die een goed opgeleide operator vereisen en schade aan meerdere weefsels veroorzaken. Een laserlaesieprotocol wordt hier gepresenteerd, waardoor controle over de laesiekenmerken en verminderde schade aan de omliggende weefsels mo…
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund door de BBSRC (BB/S0001778/1). CR wordt gefinancierd door het Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. We danken David Greenald (CRH, University of Edinburgh) en Katy Reid (CDBS, University of Edinburgh) voor het vriendelijke geschenk van transgene vis (zie aanvullend bestand). We bedanken Daniel Soong (CRH, University of Edinburgh) voor de vriendelijke toegang tot de 3i spinning-disk confocal.
Software | |||
Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
Visual Studio Code | Microsoft | ||
Microscope and accessories | |||
ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
UV laser | Micropoint | ||
VAST BioImager | Union Biometrica | ||
Labware | |||
90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
96-well plate | Corning | 3841 | |
Chemicals | |||
Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
Antibodies | |||
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
Transgenic zebrafish lines | |||
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |