अंतर्जात ड्रोसोफिला क्षणिक रिसेप्टर संभावित चैनलों की शुद्धि
Summary
आईएनएडी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के संयोजन तंत्र के आधार पर, इस प्रोटोकॉल में, अंतर्जात ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल को शुद्ध करने के लिए एक संशोधित आत्मीयता शुद्धि प्लस प्रतियोगिता रणनीति विकसित की गई थी।
Abstract
ड्रोसोफिला फोटोट्रांसडक्शन सबसे तेजी से ज्ञात जी प्रोटीन-युग्मित सिग्नलिंग मार्गों में से एक है। इस झरने की विशिष्टता और दक्षता सुनिश्चित करने के लिए, कैल्शियम (सीए2 +) -पारगम्य उद्धरण चैनल, क्षणिक रिसेप्टर क्षमता (टीआरपी), मचान प्रोटीन, निष्क्रियता-नो-आफ्टर-पोटेंशियल डी (आईएनएडी) को कसकर बांधता है, और आंख-विशिष्ट प्रोटीन किनेज सी (ईपीकेसी) और फॉस्फोलिपेज सी / हालांकि, ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल के जैव रासायनिक गुण स्पष्ट नहीं हैं। आईएनएडी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के संयोजन तंत्र के आधार पर, अंतर्जात टीआरपी चैनल को शुद्ध करने के लिए एक संशोधित आत्मीयता शुद्धि प्लस प्रतियोगिता रणनीति विकसित की गई थी। सबसे पहले, शुद्ध हिस्टिडीन (हिज) -टैग किए गए एनओआरपीए 863-1095 टुकड़े को नी-मोती से बांधा गया था और ड्रोसोफिला हेड होमोजेनेट्स से अंतर्जात आईएनएडी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को खींचने के लिए चारा के रूप में इस्तेमाल किया गया था। फिर, टीआरपी चैनल के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए नी-बीड्स में अत्यधिक शुद्ध ग्लूटाथियोन एस-ट्रांसफरेज (जीएसटी) टैग टीआरपी 1261-1275 टुकड़ा जोड़ा गया था। अंत में, सतह पर तैरनेवाला में टीआरपी चैनल को आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा अत्यधिक टीआरपी 1261-1275 पेप्टाइड से अलग किया गया था। यह विधि जैव रासायनिक और संरचनात्मक दोनों कोणों से ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल के गेटिंग तंत्र का अध्ययन करना संभव बनाती है। शुद्ध ड्रोसोफिला टीआरपी चैनलों के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी गुणों को भविष्य में भी मापा जा सकता है।
Introduction
फोटोट्रांसडक्शन एक ऐसी प्रक्रिया है जहां अवशोषित फोटॉन न्यूरॉन्स के विद्युत कोड में परिवर्तित हो जाते हैं। यह विशेष रूप से कशेरुक और अकशेरुकी दोनों में ऑप्सिन और निम्नलिखित जी प्रोटीन-युग्मित सिग्नलिंग कैस्केड को रिले करता है। ड्रोसोफिला में, अपने पांच पीडीजेड डोमेन का उपयोग करके, मचान प्रोटीन निष्क्रियता-नो-आफ्टर-पोटेंशियल डी (आईएनएडी) एक सुपरमॉलिक्युलर सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स का आयोजन करता है, जिसमें एक क्षणिक रिसेप्टर पोटेंशियल (टीआरपी) चैनल, फॉस्फोलिपेज़ सीβ / इस सुपरमॉलिक्युलर सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स का गठन सही उपकोशिकीय स्थानीयकरण, उच्च दक्षता और ड्रोसोफिला फोटोट्रांसडक्शन मशीनरी की विशिष्टता की गारंटी देता है। इस परिसर में, प्रकाश-संवेदनशील टीआरपी चैनल एनओआरपीए के डाउनस्ट्रीम प्रभावकों के रूप में कार्य करते हैं और कैल्शियम प्रवाह और फोटोरिसेप्टर के विध्रुवण की मध्यस्थता करते हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल का उद्घाटन प्रोटॉन, स्थानीय लिपिड पर्यावरण के विघटन, या यांत्रिक बल 2,3,4 द्वारा मध्यस्थता की जाती है। ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल भी शांतोडुलिन5 के साथ बातचीत करता है और सकारात्मक और नकारात्मक प्रतिक्रिया 6,7,8 दोनों द्वारा कैल्शियम द्वारा संशोधित किया जाता है।
अब तक, ड्रोसोफिला टीआरपी और टीआरपी-जैसे (टीआरपीएल) चैनलों के गेटिंग तंत्र पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन एक्साइज्ड मेम्ब्रेन पैच, अलग-अलग जंगली प्रकार के ड्रोसोफिला फोटोरिसेप्टर से पूरे सेल रिकॉर्डिंग और एस 2, एसएफ 9, या एचईके कोशिकाओं 2,9,10,11,12,13 में हेटेरो-व्यक्त चैनलों पर आधारित थे, लेकिन शुद्ध चैनलों पर नहीं। पूर्ण लंबाई वाले ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल की संरचनात्मक जानकारी भी स्पष्ट नहीं है। पुनर्गठित झिल्ली वातावरण में शुद्ध प्रोटीन के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों का अध्ययन करने और पूर्ण लंबाई वाले ड्रोसोफिला टीआरपी चैनल की संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए, शुद्ध पूर्ण लंबाई टीआरपी चैनल प्राप्त करना आवश्यक पहला कदम है, स्तनधारी टीआरपी चैनल अध्ययन 14,15,16,17 में उपयोग की जाने वाली पद्धतियों के समान।
हाल ही में, आईएनएडी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स 18,19,20 के संयोजन तंत्र के आधार पर, स्ट्रेप्टाविडिन मोती 5 द्वारा ड्रोसोफिला हेड होमोजेनेट्स से टीआरपी चैनल को शुद्ध करने के लिए एक आत्मीयता शुद्धि प्लस प्रतियोगिता रणनीतिपहली बार विकसित की गई थी। स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों की कम क्षमता और महंगी लागत को ध्यान में रखते हुए, यहां एक बेहतर शुद्धिकरण प्रोटोकॉल पेश किया गया है जो उनके टैग किए गए चारा प्रोटीन और बहुत अधिक क्षमता वाले संबंधित कम लागत वाले नी-मोतियों का उपयोग करता है। प्रस्तावित विधि संरचनात्मक कोणों से टीआरपी चैनल के गेटिंग तंत्र का अध्ययन करने और शुद्ध प्रोटीन के साथ टीआरपी चैनल के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों को मापने में मदद करेगी।
Protocol
Representative Results
Discussion
आईएनएडी, जिसमें पांच पीडीजेड डोमेन शामिल हैं, ड्रोसोफिला फोटोट्रांसडक्शन मशीनरी का मुख्य आयोजक है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि आईएनएडी पीडीजेड 3 उत्तम विशिष्टता (केडी = 0.3 μM)18 के साथ ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 31870746), शेन्ज़ेन बेसिक रिसर्च ग्रांट्स (जेसीवाईजे 20200109140414636), और गुआंग्डोंग प्रांत, चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 2021 ए 1515010796) द्वारा डब्ल्यूएल को समर्थित किया गया था। हम इस पांडुलिपि की तैयारी के दौरान अपनी भाषाई सहायता के लिए लेटपब (www.letpub.com) को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
Referências
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