Очистка эндогенных каналов транзиторных рецепторов дрозофилы
Summary
На основе механизма сборки белкового комплекса INAD в этом протоколе была разработана модифицированная стратегия аффинной очистки плюс конкуренция для очистки эндогенного канала Drosophila TRP.
Abstract
Фототрансдукция дрозофилы является одним из самых быстрых известных сигнальных путей, связанных с G-белком. Чтобы обеспечить специфичность и эффективность этого каскада, кальциевый (Ca2+)-проницаемый катионный канал, переходный рецепторный потенциал (TRP), плотно связывается с каркасным белком, инактивирующим без-после-потенциала D (INAD), и образует большой сигнальный белковый комплекс с глаз-специфической протеинкиназой C (ePKC) и фосфолипазой Cβ / No рецепторного потенциала A (PLCβ / NORPA). Однако биохимические свойства канала Drosophila TRP остаются неясными. На основе механизма сборки белкового комплекса INAD была разработана модифицированная стратегия аффинной очистки плюс конкуренция для очистки эндогенного канала TRP. Во-первых, очищенный фрагмент NORPA 863-1095, помеченный гистидином (His), был связан с Ni-шариками и использовался в качестве приманки для вытягивания эндогенного белкового комплекса INAD из гомогенатов головки Drosophila . Затем к Ni-бусинам был добавлен избыточный очищенный фрагмент TRP 1261-1275 с маркировкой ГЛУТАТИОН S-трансфераза (GST), чтобы конкурировать с каналом TRP. Наконец, канал TRP в супернатанте был отделен от избыточного пептида TRP 1261-1275 с помощью размерно-эксклюзионной хроматографии. Этот метод позволяет изучить механизм гакинга канала Drosophila TRP как с биохимического, так и со структурного угла. Электрофизиологические свойства очищенных каналов Drosophila TRP также могут быть измерены в будущем.
Introduction
Фототрансдукция — это процесс, при котором поглощенные фотоны преобразуются в электрические коды нейронов. Он исключительно передает опсины и следующий сигнальный каскад, связанный с G-белком, как у позвоночных, так и у беспозвоночных. У дрозофилы, используя пять доменов PDZ, инактивация каркасного белка без последующего потенциала D (INAD) организует супрамолекулярный сигнальный комплекс, который состоит из канала переходного рецепторного потенциала (TRP), фосфолипазного Cβ/No рецепторного потенциала A (PLCβ/NORPA) и глаз-специфической протеинкиназы C (ePKC)1. Формирование этого супрамолекулярного сигнального комплекса гарантирует правильную субклеточную локализацию, высокую эффективность и специфичность механизма фототрансдукции Drosophila. В этом комплексе светочувствительные каналы TRP действуют как нисходящие эффекторы NORPA и опосредуют приток кальция и деполяризацию фоторецепторов. Предыдущие исследования показали, что открытие канала Drosophila TRP опосредовано протонами, нарушением местной липидной среды или механической силой 2,3,4. Канал Drosophila TRP также взаимодействует с кальмодулином5 и модулируется кальцием как положительной, так и отрицательной обратной связью 6,7,8.
До сих пор электрофизиологические исследования механизма захвата каналов Drosophila TRP и TRP-подобных (TRPL) каналов были основаны на иссеченных мембранных пластырях, записях цельноклеток из диссоциированных фоторецепторов дрозофилы дикого типа и гетеро-экспрессированных каналах в клетках S2, SF9 или HEK 2,9,10,11,12,13, но не на очищенных каналах. Структурная информация о полнометражном канале Drosophila TRP также остается неясной. Для изучения электрофизиологических свойств очищенного белка в восстановленной мембранной среде и получения структурной информации о полноразмерном канале Drosophila TRP получение очищенных полноразмерных каналов TRP является необходимым первым шагом, аналогичным методологиям, используемым в исследованиях каналов TRP млекопитающих 14,15,16,17.
Недавно, на основе механизма сборки белкового комплекса INAD 18,19,20, впервые была разработана стратегия аффинной очистки плюс конкуренция для очистки канала TRP от гомогенатов головки дрозофилы бусинами стрептавидина 5. Учитывая низкую емкость и дорогую стоимость бусин стрептавидина, здесь введен улучшенный протокол очистки, в котором используется помеченный Им белок приманки и соответствующие недорогие Ni-бусины с гораздо более высокой емкостью. Предложенный метод поможет изучить механизм гатерации канала ГТО со структурных углов и измерить электрофизиологические свойства канала ГТО очищенными белками.
Protocol
Representative Results
Discussion
INAD, который содержит пять доменов PDZ, является основным организатором механизма фототрансдукции Drosophila. Предыдущие исследования показали, что INAD PDZ3 связывается с С-концевым хвостом канала ГТО с изысканной специфичностью (KD = 0,3 мкМ)18. Тандем INAD PDZ45 взаимодействует ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No 31870746), грантами на фундаментальные исследования в Шэньчжэне (JCYJ20200109140414636) и Фондом естественных наук провинции Гуандун, Китай (No 2021A1515010796) W. L. Мы благодарим LetPub (www.letpub.com) за лингвистическую помощь при подготовке этой рукописи.
Materials
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
Referências
- Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
- Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
- Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
- Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
- Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
- Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
- Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
- Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
- Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. Neurociência. 396, 66-72 (2019).
- Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
- Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
- Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).
- Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
- Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075 (2019).
- Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191 (2020).
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
- Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
- Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
- Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
- Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
- Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. . Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), (2005).
- Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
- Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
- Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).
