Uma metodologia coerente de imagem de dispersão raman para visualizar e quantificar compostos farmacêuticos dentro da pele é descrita. Este artigo descreve a preparação do tecido da pele (humano e camundongo) e a aplicação da formulação tópica, aquisição de imagens para quantificar perfis de concentração esposteis e análises farmacocinéticas preliminares para avaliar a entrega de medicamentos tópicos.
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Artigo de método
Visualizando e quantificando compostos farmacêuticos dentro da pele usando imagens coerentes de dispersão de Raman
Neste artigo
Resumo
Resumo
Farmacocinética cutânea (cPK) após a aplicação da formulação tópica tem sido uma área de pesquisa de particular interesse para cientistas reguladores e de desenvolvimento de medicamentos para entender mecanicamente a biodisponibilidade tópica (BA). Técnicas semi-invasivas, como descascamento de fitas, microdiálise dérmica ou microperfusão de fluxo aberto dérmico, todas quantificam a macroescala cPK. Embora essas técnicas tenham proporcionado vasto conhecimento de CPK, a comunidade carece de uma compreensão mecanicista da penetração e permeação de ingredientes farmacêuticos ativos (API) no nível celular.
Uma abordagem não invasiva para abordar a microescala cPK é a imagem de dispersão raman coerente (CRI), que tem como alvo seletivamente vibrações moleculares intrínsecas sem a necessidade de rótulos extrínsecos ou modificações químicas. O CRI tem dois métodos principais de dispersão anti-Stokes Raman (CARS) e estimulado a dispersão de Raman (SRS) - que permitem quantificação sensível e seletiva de APIs ou ingredientes inativos. Os CARROS são normalmente utilizados para obter informações estruturais da pele ou visualizar contraste químico. Em contraste, o sinal srs, que é linear com concentração molecular, é usado para quantificar APIs ou ingredientes inativos dentro de estratificações de pele.
Embora o tecido do camundongo tenha sido comumente utilizado para cPK com CRI, BA tópico e bioequivalência (BE) devem, em última análise, ser avaliados em tecido humano antes da aprovação regulatória. Este artigo apresenta uma metodologia de preparação e imagem da pele ex vivo a ser utilizada em estudos cri farmacocinéticos quantitativos na avaliação da BA e DO tópicos. Essa metodologia permite quantificação de API confiável e reprodutível na pele humana e do rato ao longo do tempo. As concentrações dentro de compartimentos ricos em lipídios e lipídios, bem como a concentração total de API ao longo do tempo são quantificadas; estes são utilizados para estimativas de BA micro e macroescala e, potencialmente, BE.
Introdução
Metodologias para avaliar a PP após a aplicação de produtos medicamentos tópicos se expandiram a partir de estudos clássicos de permeação in vitro (IVPT) estudos 1,2,3,4,5 e tape-stripping 6,7,8 para metodologias adicionais como microperfusão de fluxo aberto ou microdiálise dérmica 9,10,11,
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Protocolo
O uso de tecido de orelha de rato nu foi aprovado pelo Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), enquanto o uso de tecido de pele humana foi aprovado pelo Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (IRB). De acordo com os protocolos da IACUC, camundongos recém-eutanásiados foram obtidos de colaboradores com colônias de ratos nus. O tecido humano foi adquirido a partir de procedimentos eletivos de abdominoplastia no Hospital Geral de Massachusetts através de um protocolo aprovado. Além disso, tipos específicos de tecidos diferentes da pele abdominal foram adquiridos por meio de uma autoridade de doação corporal, ....
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Resultados
A imagem é considerada bem sucedida se o tecido não tiver se movido significativamente tanto no axial (<10 μm) quanto na direção lateral após a conclusão do experimento (Figura 4). Esta é uma indicação imediata se a medição srs para a API de interesse não é representativa da profundidade inicial, para a qual a quantificação é específica de camada. Isso é mitigado por pilhas z de imagem para cada posição de interesse XY, com a compensação sendo a resolução temporal. Se a pele congelada for.......
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Discussão
A avaliação da BA/BE atual é uma área de pesquisa que requer uma abordagem multifacetada, pois nenhum método único pode caracterizar totalmente in vivo cPK. Este protocolo apresenta uma metodologia para a avaliação da BA/BE de um produto de medicamentos tópicos com base em imagens raman coerentes. Um dos primeiros pontos que podem ser negligenciados é o quão finas as amostras de pele devem ser, especialmente para a transmissão quantitativa de imagens srs. Se a pele é muito grossa (ou seja, a luz não pod.......
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Divulgações
A CLE é uma inventora de patentes para microscopia CARS que foram licenciadas para vários fabricantes de microscópio. Todos os outros autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Fotis Iliopoulos e Daniel Greenfield do Grupo Evans por sua discussão e revisão deste manuscrito. Além disso, os autores gostariam de reconhecer o apoio da LEO Pharma. A Figura 2 foi criada com BioRender.com.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tissue Preparation | |||
| Autoclavable Biohazard Bags | FisherBrand | 22-044562 | Conforme referido no texto: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562& searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562 |
| Tampões de cultura de células: Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco 1x | Corning | MT21030CV | Conforme referido no texto: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv& searchType= RAPID& matchedCatNo=21-030-cv |
| Bisturis Descartáveis | Exel International | 14-840-00 | Como referido no texto: bisturi https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
| Alta Precisão 45° Pinça/fórceps de ponta larga angular | Fisherbrand | 12-000-132 | Conforme referido no texto: fórceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
| Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | Conforme referido no texto: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
| Parafilm M Filme de Embalagem de Laboratório | Bemis | 13-374-12 | Conforme referido no texto: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
| Placa de Petri (35 mm x 10 mm) | Fisherbrand | FB0875711YZ | Conforme referido no texto: placa de Petri pequena https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
| Placa de Petri (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB0875713A | Conforme referido no texto: placa de Petri grande https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
| Tesoura Cirúrgica | Roboz | NC9411473 | Conforme referido no texto: tesoura https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC& searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC |
| strong>Laser/microscópio | |||
| 650/60 nm BrightLine filtro passa-banda de banda única | Semrock | Conforme referido no texto: Filtro CARS - vibrações CH2 (filtro de 645nm/60nm) | |
| Caixa de controle IX2-UCB | Olympus | Conforme referido no texto: Caixa de controle | |
| D700/30m | Chroma | Conforme referido no texto: Filtro CARS - banda deuterada https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m | |
| DeepSee Insight | Spectra-Physics | Conforme referido no texto: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser | |
| Console do medidor de energia e potência óptica portátil digital | ThorLabs | PM100D | Conforme referido no texto: medidor de potência https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Fluoview Software | Olympus | Conforme referido no texto: Software de controle de microscópio | |
| Lâminas de microscópio fosco | FisherBrand | Conforme referido no texto: lâminas de microscópio https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 | |
| FV1000 | Olympus | Conforme referido no texto: Câmara | |
| de Incubação | Tokai Hit | GM-800 | Conforme referido no texto: câmara de incubação |
| Esfera Integradora Sensor de Potência de Fotodiodo | ThorLabs | S142C | Conforme referido no texto: fotodiodo https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Fonte de alimentação FV31-PSU | Olympus | Conforme referido no texto: Fonte de | |
| Alimentação Precision 4063, Gerador de Função de Canal Duplo de 80MHz | BK Precision | Conforme referido no texto: gerador de função | |
| ProScan - ndash; Automação de Microscópio de Precisão | Instrumentos Científicos Anteriores | Conforme referido no texto: controlador de platina https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation | |
| Espaçadores de imagem SecureSeal | Grace Biolabs | 654004 | Conforme referido no texto: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
| Kit de Detecção SRS | APE | Como referido no texto: Detector SRS | |
| UPLSAPO 20X NA:0.75 | Olympus | Como referido no texto: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ | |
| Lipid/Drug Imaging | |||
| Prato de 35 mm, Nº 0 Lamínula não revestida, Diâmetro de vidro de 14 mm | MatTek Corporation | NC9711297 | Conforme referido no texto: Prato com fundo de vidro https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
| Aplicadores com ponta de algodão | FisherBrand | Conforme referido no texto: Aplicador com ponta de algodão | |
| Distriman Pipeta de deslocamento positivo | Gilson | Conforme referido no texto: Pipeta de Deslocamento Positivo https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= | |
| Distriman Pontas de Pipeta de Deslocamento Positivo | Gilson | Conforme referido no texto: Pontas para pipeta https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true | |
| Análise de Dados | |||
| FIJI | Open-source | Conforme referido no texto: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ | |
| Jupyter-Lab | open-source | Conforme referido no texto: JupyterLab https://jupyter.org/ | |
| Rstudio | Open-source | Conforme referido no texto: Rstudio https://www.rstudio.com/ |
Referências
- Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J. In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology. Transdermal and topical drug delivery: principles and practice. Benson, H. E., Watkinson, A. C. , John Wiley & Sons. Hoboken NJ USA. 85-108 (2012).
- Shin, S. H., et al.
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Reimpressões e permissões
