विवो निषेध, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके शुक्राणुकोशिकाओं में काइन्सिन -7 सीईएनपी-ई का कार्यात्मक मूल्यांकन
Summary
यह लेख पेट की सर्जरी और GSK923295 के वृषण इंजेक्शन के माध्यम से सीईएनपी-ई के इनविवो निषेध की रिपोर्ट करता है, जो पुरुष मियोटिक विभाजन के लिए एक मूल्यवान मॉडल है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस, फ्लो साइटोमेट्री और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी परख का उपयोग करते हुए, हम दिखाते हैं कि सीईएनपी-ई निषेध के परिणामस्वरूप माउस शुक्राणुकोशिकाओं में गुणसूत्र गलत संरेखण और जीनोम अस्थिरता होती है।
Abstract
यूकेरियोट्स में, यौन प्रजनन में जीनोम स्थिरता और आनुवंशिक विविधता के लिए अर्धसूत्रीविभाजन आवश्यक है। वृषण में शुक्राणुकोशिकाओं के प्रयोगात्मक विश्लेषण पुरुष मियोटिक विभाजन में स्पिंडल असेंबली और क्रोमोसोम अलगाव की जांच के लिए महत्वपूर्ण हैं। माउस शुक्राणुकोशिका अर्धसूत्रीविभाजन के यंत्रवत अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल है, हालांकि, शुक्राणुकोशिकाओं के विश्लेषण के लिए प्रभावी तरीकों की कमी है। इस लेख में, माउस शुक्राणुकोशिकाओं में काइन्सिन -7 सीईएनपी-ई के इनविवो निषेध के लिए एक व्यावहारिक और कुशल विधि बताई गई है। 3 सप्ताह के चूहों में पेट की सर्जरी के माध्यम से GSK923295 एक विशिष्ट अवरोधक के वृषण इंजेक्शन के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रस्तुत की गई है। इसके अलावा, यहां वर्णित ऊतक संग्रह और निर्धारण, हेमटोक्सिलिन-ईओसिन धुंधला, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, फ्लो साइटोमेट्री और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला है। यहां हम पेट की सर्जरी और वृषण इंजेक्शन के माध्यम से एक इनविवो निषेध मॉडल प्रस्तुत करते हैं, जो पुरुष अर्धसूत्रीविभाजन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक हो सकती है। हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि सीईएनपी-ई निषेध के परिणामस्वरूप अर्धसूत्रीविभाजन I के दौरान प्राथमिक शुक्राणुकोशिकाओं में गुणसूत्र गलत संरेखण और मेटाफ़ेज़ गिरफ्तारी होती है। हमारी इन विवो निषेध विधि अर्धसूत्रीविभाजन के यंत्रवत अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगी, पुरुष रोगाणु लाइनों के आनुवंशिक संशोधनों के लिए एक उपयोगी विधि के रूप में काम करेगी, और भविष्य के नैदानिक अनुप्रयोगों पर प्रकाश डालेगी।
Introduction
अर्धसूत्रीविभाजन यूकेरियोटिक जीवों में सबसे महत्वपूर्ण, अत्यधिक कठोर, विकासवादी संरक्षित घटनाओं में से एक है, और गैमेटोजेनेसिस, यौन प्रजनन, जीनोम अखंडता और आनुवंशिक विविधता 1,2,3 के लिए आवश्यक है। स्तनधारियों में, रोगाणु कोशिकाएं डीएनए प्रतिकृति के एक दौर के बाद दो क्रमिक कोशिका विभाजन, अर्धसूत्रीविभाजन I और II से गुजरती हैं। माइटोसिस में बहन क्रोमैटिड के विपरीत, डुप्लिकेट होमोलोगस क्रोमोसोम अर्धसूत्रीविभाजन I 4,5 के दौरान दो बेटी कोशिकाओं में जुड़ते हैं और अलग होते हैं। अर्धसूत्रीविभाजन II में, बहन क्रोमैटिड डीएनए प्रतिकृतिके बिना अगुणित युग्मक बनाने के लिए अलग और अलग हो जाते हैं। स्पिंडल असेंबली दोष और क्रोमोसोम मिससेग्रीगेशन सहित दो मियोटिक डिवीजनों में से किसी एक में गलतियों के परिणामस्वरूप युग्मकों, बाँझपन या एन्यूप्लोइडी सिंड्रोम 7,8,9 का नुकसान हो सकता है।
संचित अध्ययनों से पता चला है कि किन्सिन परिवार मोटर्स क्रोमोसोम संरेखण और अलगाव, स्पिंडल असेंबली, साइटोकिनेसिस और माइटोटिक और मियोटिककोशिकाओं दोनों में कोशिका चक्र प्रगति के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। काइन्सिन -7 सीईएनपी-ई (सेंट्रोमियर प्रोटीन ई) क्रोमोसोम कांग्रेस, क्रोमोसोम परिवहन और संरेखण के लिए आवश्यक एक प्लस-एंड-निर्देशित किनेटोकोर मोटर है, और माइटोसिस 13,14,15,16,17,18 में स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट का विनियमन है। अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान, विशिष्ट अवरोधक द्वारा सीईएनपी-ई अवरोध GSK923295 कोशिका चक्र गिरफ्तारी, गुणसूत्र गलत संरेखण, स्पिंडल विघटन और शुक्राणुजनककोशिकाओं में जीनोम अस्थिरता की ओर जाता है। विभाजित शुक्राणुकोशिकाओं के सेंट्रोमियर पर सीईएनपी-ई के स्थानीयकरण पैटर्न और गतिशीलता से संकेत मिलता है कि सीईएनपी-ई अर्धसूत्रीविभाजन I20,21 के दौरान सेंट्रोमियर की अनुक्रमिक असेंबली के लिए किनेटोकोर प्रोटीन के साथ बातचीत करता है। अंडाणुओं में, क्रोमोसोम संरेखण और अर्धसूत्रीविभाजन I13,22,23 के पूरा होने के लिए सीईएनपी-ई की आवश्यकता होती है। सीईएनपी-ई के एंटीबॉडी या मोर्फोलिनो इंजेक्शन के परिणामस्वरूप गलत संरेखित गुणसूत्र, असामान्य किनेटोकोर अभिविन्यास और अर्धसूत्रीविभाजन होता है जो माउस और ड्रोसोफिला अंडाणुओं दोनों में होता है। माइटोसिस में सीईएनपी-ई की आवश्यक भूमिकाओं की तुलना में, अर्धसूत्रीविभाजन में सीईएनपी-ई के कार्य और तंत्र काफी हद तक अज्ञात रहते हैं। क्रोमोसोम कांग्रेस में सीईएनपी-ई के विस्तृत तंत्र और पुरुष मियोटिक कोशिकाओं में जीनोम स्थिरता को स्पष्ट किया जाना बाकी है।
शुक्राणुजनन एक जटिल और लंबे समय तक चलने वाली शरीर विज्ञान प्रक्रिया है, जिसमें अनुक्रमिक शुक्राणुजनन प्रसार, अर्धसूत्रीविभाजन और शुक्राणुजनन शामिल हैं। इसलिए, स्तनधारियों और अन्य प्रजातियों24,25 में विट्रो में पूरी प्रक्रिया को पुन: पेश करना असाधारण रूप से मुश्किल है। विट्रो में पचीटेन चरण के बाद शुक्राणुकोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित करना असंभव है। पुरुष मियोटिक डिवीजनों पर अध्ययन आम तौर पर प्रारंभिक मियोटिक प्रोफ़ेज़25,26 के प्रयोगात्मक विश्लेषण तक सीमित रहे हैं। कई तकनीकी प्रयासों के बावजूद, जिसमें शुक्राणुकोशिकाओं की अल्पकालिक संस्कृति27,28 और अंग संस्कृति विधियां25 शामिल हैं, पुरुष मियोटिक विभाजन का अध्ययन करने के लिए कुछ प्रभावी तरीके हैं। इसके अलावा, आवश्यक जीन ों के आनुवंशिक विलोपन के परिणामस्वरूप आमतौर पर विकासात्मक गिरफ्तारी और भ्रूण घातकता होती है। उदाहरण के लिए, सीईएनपी-ई की कमी वाले माउस भ्रूण प्रत्यारोपण में विफल रहते हैं और पिछले आरोपण29 को विकसित नहीं कर सकते हैं, जो अर्धसूत्रीविभाजन में सीईएनपी-ई के यांत्रिक अध्ययन में एक बाधा है। एक साथ लिया गया, पुरुष मियोटिक विभाजन का अध्ययन करने के लिए एक व्यावहारिक और व्यवहार्य प्रणाली स्थापित करना अर्धसूत्रीविभाजन के अनुसंधान क्षेत्र को बहुत बढ़ावा दे सकता है।
छोटे सेल-पारगम्य अवरोधक कोशिका विभाजन और विकास प्रक्रियाओं में काइन्सिन मोटर्स का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। एलोस्टेरिक अवरोधक, GSK923295, विशेष रूप से सीईएनपी-ई मोटर डोमेन को बांधता है, एडीपी (एडेनोसिन डाइफॉस्फेट) की रिहाई को अवरुद्ध करता है, और अंत में सीईएनपी-ई और सूक्ष्मनलिकाएं30 के बीच बातचीत को स्थिर करता है। इस अध्ययन में, पेट की सर्जरी और GSK923295 के वृषण इंजेक्शन के माध्यम से एक इनविवो निषेध माउस मॉडल प्रस्तुत किया जाता है। सीईएनपी-ई निषेध के परिणामस्वरूप प्राथमिक शुक्राणुकोशिकाओं के मेटाफ़ेज़ I में क्रोमोसोम गलत संरेखण होता है। इसके अलावा, सीईएनपी-ई निषेध शुक्राणुकोशिकाओं की मियोटिक गिरफ्तारी और शुक्राणुजनन के विघटन की ओर जाता है। शुक्राणुकोशिकाओं के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला का वर्णन किया गया है और शुक्राणुकोशिकाओं में मियोटिक स्पिंडल सूक्ष्मनलिकाएं, समरूप गुणसूत्र और उपकोशिकीय जीवों का निरीक्षण करने के लिए लागू किया जा सकता है। हमारी विवो निषेध विधि मियोटिक विभाजन और शुक्राणुजनन के अध्ययन के लिए एक प्रभावी तरीका है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, हमने पेट की सर्जरी और GSK923295 के माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग करके माउस वृषण के विवो सीईएनपी-ई निषेध मॉडल की स्थापना की है। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली पेट की सर्जरी और वृषण इंजेक्शन विधि…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उपयोगी चर्चाओं के लिए फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी में साइटोस्केलेटन प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम फ्लो साइटोमेट्री में तकनीकी सहायता के लिए सार्वजनिक प्रौद्योगिकी सेवा केंद्र, फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी में जून-जिन लिन को धन्यवाद देते हैं। हम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में तकनीकी सहायता के लिए सार्वजनिक प्रौद्योगिकी सेवा केंद्र, फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी लैब में मिंग-ज़िया वू और लिन-यिंग झोउ को धन्यवाद देते हैं। हम फुजियान मेडिकल यूनिवर्सिटी में बेसिक मेडिकल साइंसेज के प्रायोगिक शिक्षण केंद्र में सी-यी झेंग, यिंग लिन, क्यूई के, और जून सांग को उनके समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था: चीन का राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 82001608), फ़ुज़ियान प्रांत, चीन का प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2019 जे 05071), फ़ुज़ियान प्रांतीय स्वास्थ्य प्रौद्योगिकी परियोजना (अनुदान संख्या 2018-1-69), वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए स्टार्टअप फंड, फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी (अनुदान संख्या 2017एक्सक्यू 1001), फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी उच्च स्तरीय प्रतिभा वैज्ञानिक अनुसंधान स्टार्ट-अप फंडिंग परियोजना (अनुदान संख्या XRCZX2017025) और अनुसंधान परियोजना। चीनी चिकित्सा स्नातक छात्रों की ऑनलाइन शिक्षा और शिक्षण (अनुदान संख्या बी-YXC20200202-06)।
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
| 95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
| tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
| Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
| Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
| Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
| Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
| Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
| Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
| Formaldehyde – aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
| ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
| Leica ultramicrotome | Leica | ||
| Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
| Nail polish | Several commercial brands available | ||
| Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
| Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
| Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
| Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
| Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
| Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |
Referências
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