in vivo阻害、免疫蛍光法およびフローサイトメトリーを用いた精母細胞におけるキネシン-7 CENP-Eの機能評価(英語)
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital,Affiliated Hospital of Fujian Medical University
Summary
本稿では,男性減数分裂の貴重なモデルであるGSK923295の腹部手術と精巣注射によるCENP-Eの in vivo 阻害について報告する.免疫蛍光法、フローサイトメトリー法、透過型電子顕微鏡アッセイを用いて、CENP-E阻害がマウス精母細胞に染色体のミスアライメントとゲノム不安定性をもたらすことを示しています。
Abstract
真核生物では、減数分裂は有性生殖におけるゲノムの安定性と遺伝的多様性に不可欠です。精巣の精母細胞の実験的解析は、雄減数分裂における紡錘体集合と染色体分配の研究に重要です。マウス精母細胞は減数分裂の機構研究に理想的なモデルですが、精母細胞を分析するための効果的な方法が不足しています。本論文では、マウス精母細胞におけるキネシン-7 CENP-Eのin vivo阻害のための実用的かつ効率的な方法が報告されています。3週齢のマウスにおける腹部手術による特異的阻害剤の精巣注射GSK923295詳細な手順が提示される。さらに、ここでは、組織採取および固定、ヘマトキシリン-エオジン染色、免疫蛍光法、フローサイトメトリーおよび透過型電子顕微鏡法のための一連のプロトコルについて説明する。ここでは、男性の減数分裂を研究するための強力な手法となる可能性のある、腹部手術と精巣注射によるin vivo阻害モデルを紹介します。また、CENP-E阻害が減数分裂I期の初代精母細胞における染色体のずれと中期停止をもたらすことを実証します。私たちのin vivo阻害法は、減数分裂の機構研究を容易にし、雄生殖系列の遺伝子改変に有用な方法として役立ち、将来の臨床応用に光を当てます。
Introduction
減数分裂は、真核生物における最も重要で、非常に剛性が高く、進化的に保存されたイベントの1つであり、配偶子形成、有性生殖、ゲノムの完全性、および遺伝的多様性に不可欠です1,2,3。哺乳類では、生殖細胞は、DNA複製の1ラウンド後に、減数分裂IおよびIIの2つの連続した細胞分裂を受ける。有糸分裂の姉妹染色分体とは異なり、重複した相同染色体はペアになり、減数分裂Iの間に2つの娘細胞に分離します4,5。減数分裂IIでは、姉妹染色分体が引き離されて分離し、DNA複製のない一倍体配偶子を形成します6。紡錘体アセンブリの欠陥や染色体の誤分離など、2つの減数分裂のいずれかの間違いは、配偶子の喪失、不妊または異数性症候群を引き起こす可能性があります7,8,9。
蓄積された研究は、キネシンファミリーモーターが有糸分裂細胞と減数分裂細胞の両方で染色体の整列と分配、紡錘体集合、細胞質分裂、および細胞周期の進行の調節に重要な役割を果たすことを示しています10,11,12。キネシン-7 CENP-E(セントロメアプロテインE)は、染色体会議、染色体輸送と整列、および有糸分裂13,14,15,16,17,18における紡錘体集合チェックポイントの調節に必要なプラスエンド指向性動原体モーターです。減数分裂の間、特異的阻害剤によるCENP-E阻害GSK923295、精子形成細胞の細胞周期停止、染色体ミスアライメント、紡錘体解体、およびゲノム不安定性につながります19。分裂する精母細胞のセントロメアにおけるCENP-Eの局在パターンとダイナミクスは、CENP-Eが減数分裂中のセントロメアの連続的な集合のために動原体タンパク質と相互作用することを示していますI20,21。卵母細胞では、CENP-Eは染色体の整列と減数分裂Iの完了に必要です13、22、23。CENP-Eの抗体またはモルホリノ注射は、染色体の不整列、異常な動原体の配向、およびマウスおよびショウジョウバエ卵母細胞の両方における減数分裂I停止をもたらす23。有糸分裂におけるCENP-Eの本質的な役割と比較して、減数分裂におけるCENP-Eの機能とメカニズムはほとんど不明のままです。CENP-Eの染色体会議における詳細なメカニズムと雄減数分裂細胞におけるゲノム安定性は、まだ明らかにされていません。
精子形成は複雑で長期にわたる生理機能プロセスであり、連続的な精原細胞の増殖、減数分裂、精子形成が含まれます。したがって、プロセス全体を哺乳動物および他の種においてインビトロで再現することは極めて困難である24、25。インビトロでパキテン期以降の精母細胞分化を誘導することは不可能である。雄減数分裂に関する研究は、一般に、初期減数分裂前期の実験的解析に限定されてきた25,26。精母細胞の短期培養27,28や臓器培養法25など、多くの技術的努力にもかかわらず、男性の減数分裂を研究するための効果的な方法はほとんどありません。さらに、必須遺伝子の遺伝的欠失は、通常、発生停止と胚致死をもたらします。例えば、CENP-Eを欠くマウス胚は着床に失敗し、過去の着床を発達させることができず29、これは減数分裂におけるCENP-Eの機構的研究における障害となっている。まとめると、男性減数分裂を研究するための実用的で実行可能なシステムを確立することは、減数分裂の研究分野を大いに促進することができます。
小細胞透過性阻害剤は、細胞分裂および発生過程におけるキネシンモーターを研究するための強力なツールです。アロステリック阻害剤であるGSK923295は、CENP-Eモータードメインに特異的に結合し、ADP(アデノシン二リン酸)の放出をブロックし、最終的にCENP-Eと微小管との間の相互作用を安定化させる30。この研究では、 in vivo 阻害マウスモデルが、腹部手術と精巣注射によって提示されます GSK923295。CENP-E阻害は、初代精母細胞の中期Iにおいて染色体のミスアライメントをもたらす。さらに、CENP-E阻害は、精母細胞の減数分裂停止および精子形成の破壊をもたらす。精母細胞の分析には一連のプロトコルが記載されており、精母細胞における減数分裂紡錘体微小管、相同染色体、および細胞内小器官の観察に適用できます。私たちの in vivo 阻害法は、減数分裂と精子形成の研究に効果的な方法です。
Protocol
すべての動物実験は、福建医科大学の動物管理および使用委員会によってレビューおよび承認されました(プロトコル番号SYXK 2016-0007)。すべてのマウス実験は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用の関連ガイドライン(NIH出版物番号8023、改訂1978)に従って実施されました。 1. GSK923295を介したCENP-E阻害マウスモデルの構築 手術器具を121°Cで30分間滅菌…
Representative Results
我々は、GSK92329519の腹部手術と精巣注射によるマウス精巣のin vivo CENP-E阻害モデルの構築に成功しました。この方法の主要な技術的ステップを図1に示します。GSK923295の精巣注射を4日間行った後、さらなる分析のために精巣を採取した。対照群では、精細管における精子形成波は規則的で組織化されていた(図2A)。しかし、GSK…
Discussion
本研究では、腹部手術とGSK923295のマイクロインジェクションを用いて、マウス精巣の de vivoCENP-E阻害モデルを確立しました。本研究で用いた腹部手術と精巣注射法には、以下のような利点があります。第一に、マウスの年齢に限定されない。実験者は、早期に、例えば3週齢以下のマウスで精巣注射を行うことができる。第二に、GSK923295はCENP-Eに対して特異的かつ優れた阻害効果を有す?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
有益な議論をしてくれた福建医科大学の細胞骨格研究室のすべてのメンバーに感謝します。フローサイトメトリーの技術支援をしてくださった福建医科大学公共技術サービスセンターのJun-Jin Linに感謝します。福建医科大学公共技術サービスセンターの電子顕微鏡研究所のMing-XiaWu氏とLin-Ying Zhou氏に、電子顕微鏡の技術支援に感謝します。福建医科大学基礎医学実験教育センターのSi-Yi Zheng、Ying Lin、Qi Ke、Jun Songの支援に感謝します。この研究は、中国国家自然科学財団(助成金番号82001608)、中国福建省自然科学財団(助成金番号2019J05071)、福建省健康技術プロジェクト(助成金番号2018-1-69)、福建医科大学科学研究スタートアップ基金(助成金番号2017XQ1001)、福建医科大学高レベル人材科学研究スタートアップ資金プロジェクト(助成金番号XRCZX2017025)、研究プロジェクト漢方薬大学院生のオンライン教育と教育(助成金番号B-YXC20200202-06)。
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
| 95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
| tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
| Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
| Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
| Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
| Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
| Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
| Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
| Formaldehyde – aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
| ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
| Leica ultramicrotome | Leica | ||
| Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
| Nail polish | Several commercial brands available | ||
| Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
| Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
| Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
| Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
| Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
| Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |
Referências
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Citar este artigo
Xu, M., Yang, Y., Wei, Y., Zhang, J., Lin, X., Lin, X., Chen, H., She, Z. Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (178), e63271, doi:10.3791/63271 (2021).