JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Biologia

Funksjonsvurdering av kinesin-7 CENP-E i spermatocytter ved bruk av in vivo hemming, immunfluorescens og flowcytometri

Published: December 28, 2021
doi:
10.3791/63271
, , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital,Affiliated Hospital of Fujian Medical University

Summary

Denne artikkelen rapporterer en in vivo hemming av CENP-E gjennom abdominal kirurgi og testikkelinjeksjon av GSK923295, en verdifull modell for mannlig meiotisk deling. Ved hjelp av immunfluorescens, flowcytometri og transmisjonselektronmikroskopianalyser viser vi at CENP-E-hemming resulterer i kromosomfeilstilling og genominstabilitet i musespermatocytter.

Abstract

I eukaryoter er meiose avgjørende for genomstabilitet og genetisk mangfold i seksuell reproduksjon. Eksperimentelle analyser av spermatocytter i testikler er avgjørende for undersøkelsene av spindelmontering og kromosomsegregering i mannlig meiotisk divisjon. Musespermatocytten er en ideell modell for mekanistiske studier av meiose, men de effektive metodene for analyse av spermatocytter mangler. I denne artikkelen rapporteres en praktisk og effektiv metode for in vivo-hemming av kinesin-7 CENP-E i spermatocytter fra mus. En detaljert prosedyre for testikkelinjeksjon av en spesifikk inhibitor GSK923295 gjennom abdominal kirurgi hos 3 uker gamle mus presenteres. Videre er beskrevet her en serie protokoller for vevsinnsamling og fiksering, hematoksylin-eosinfarging, immunfluorescens, flowcytometri og transmisjonselektronmikroskopi. Her presenterer vi en in vivo inhiberingsmodell via abdominal kirurgi og testikkelinjeksjon, som kan være en kraftig teknikk for å studere mannlig meiose. Vi demonstrerer også at CENP-E-hemming resulterer i kromosomfeilstilling og metafasestans i primære spermatocytter under meiose I. Vår in vivo inhiberingsmetode vil legge til rette for mekanistiske studier av meiose, tjene som en nyttig metode for genetiske modifikasjoner av mannlige kjønnslinjer, og kaste lys over fremtidige kliniske anvendelser.

Introduction

Meiose er en av de viktigste, svært stive, evolusjonære konserverte hendelsene i eukaryote organismer, og er avgjørende for gametogenese, seksuell reproduksjon, genomintegritet og genetisk mangfold 1,2,3. Hos pattedyr gjennomgår kimcellene to påfølgende celledelinger, meiose I og II, etter en enkelt runde med DNA-replikasjon. I motsetning til søsterkromatider i mitose, parrer dupliserte homologe kromosomer seg og segregerer i to datterceller under meiose I 4,5. I meiose II trekker søsterkromatider fra hverandre og segregerer for å danne haploide kjønnsceller uten DNA-replikasjon6. Feil i en av de to meiotiske divisjonene, inkludert spindelmonteringsfeil og kromosomfeilsegregering, kan føre til tap av kjønnsceller, sterilitet eller aneuploidisyndromer 7,8,9.

Akkumulerende studier har vist at kinesinfamiliemotorer spiller en avgjørende rolle i reguleringen av kromosomjustering og segregering, spindelmontering, cytokinese og cellesyklusprogresjon i både mitotiske og meiotiske celler10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (Centromere protein E) er en pluss-ende-rettet kinetochore motor som kreves for kromosomkongress, kromosomtransport og justering, og regulering av spindelmonteringskontrollpunkt i mitose 13,14,15,16,17,18. Under meiose fører CENP-E-hemming av den spesifikke inhibitoren GSK923295 til cellesyklusstans, kromosomfeiljustering, spindeldisorganisering og genominstabilitet i spermatogene celler19. Lokaliseringsmønstrene og dynamikken til CENP-E ved sentromerer av delende spermatocytter indikerer at CENP-E interagerer med kinetochoreproteiner for sekvensiell montering av sentromerer under meiose I20,21. I oocytter er CENP-E nødvendig for kromosomjustering og fullføring av meiose I13,22,23. Antistoffer eller morfolinoinjeksjon av CENP-E resulterer i feiljusterte kromosomer, unormal kinetochore orientering og meiose jeg arresterer i både mus og Drosophila oocytter23. Sammenlignet med de essensielle rollene til CENP-E i mitose, forblir funksjonene og mekanismene til CENP-E i meiose stort sett ukjente. Detaljerte mekanismer for CENP-E i kromosomkongress og genomstabilitet i mannlige meiotiske celler gjenstår å bli avklart.

Spermatogenese er en kompleks og langvarig fysiologisk prosess, som involverer sekvensiell spermatogonia-proliferasjon, meiose og spermiogenese. Derfor er hele prosessen usedvanlig vanskelig å reprodusere in vitro hos pattedyr og andre arter24,25. Det er umulig å indusere spermatocytter differensiering etter pachytenstadiet in vitro. Studier på mannlige meiotiske divisjoner har generelt vært begrenset til eksperimentelle analyser av tidlig meiotisk profase25,26. Til tross for mange teknologiske bestrebelser, inkludert kortsiktig kultur av spermatocytter27,28 og organkulturmetoder25, er det få effektive metoder for å studere mannlig meiotisk deling. Videre resulterer genetisk sletting av essensielle gener vanligvis i utviklingsstans og embryonal dødelighet. For eksempel klarer ikke museembryoer som mangler CENP-E å implantere og kan ikke utvikle tidligere implantasjon29, noe som er et hinder i mekanistiske studier av CENP-E i meiose. Samlet sett kan etablering av et praktisk og gjennomførbart system for å studere mannlig meiotisk divisjon i stor grad fremme forskningsfeltet meiose.

Den lille cellepermeable inhibitoren er et kraftig verktøy for å studere kinesinmotorer i celledeling og utviklingsprosesser. Den allosteriske inhibitoren, GSK923295, binder seg spesifikt til CENP-E motorisk domene, blokkerer frigivelsen av ADP (adenosindifosfat), og stabiliserer til slutt interaksjonene mellom CENP-E og mikrotubuli30. I denne studien presenteres en in vivo hemmingsmusemodell ved abdominalkirurgi og testikkelinjeksjon av GSK923295. CENP-E-hemming resulterer i kromosomfeilstilling i metafase I av primære spermatocytter. Videre fører CENP-E-hemming til meiotisk stans av spermatocytter og forstyrrelse av spermatogenese. En rekke protokoller er beskrevet for analyse av spermatocytter og kan brukes til å observere meiotiske spindelmikrotubuli, homologe kromosomer og subcellulære organeller i spermatocytter. Vår in vivo inhiberingsmetode er en effektiv metode for studier av meiotisk deling og spermatogenese.

Protocol

Alle dyreforsøk ble gjennomgått og godkjent av Animal Care and Use Committee ved Fujian Medical University (protokollnummer SYXK 2016-0007). Alle museforsøk ble utført i samsvar med de relevante retningslinjene for omsorg og bruk av forsøksdyr fra National Institutes of Health (NIH-publikasjonsnummer 8023, revidert 1978). 1. Konstruksjon av GSK923295-medierte CENP-E hemming musemodeller Steriliser de kirurgiske instrumentene ved 121 °C i 30 minutter. Bestråle …

Representative Results

Vi har lykkes med å konstruere en in vivo CENP-E hemmingsmodell av musetestikler gjennom abdominal kirurgi og testikkelinjeksjon avGSK923295 19. De viktigste tekniske trinnene i denne metoden ble vist i figur 1. Etter testikkelinjeksjon av GSK923295 i 4 dager ble testiklene høstet for videre analyser. I kontrollgruppen var den spermatogene bølgen i sædkanalene regelmessig og organisert (figur 2A). I den GSK923295 gruppen ble …

Discussion

I denne studien har vi etablert en in vivo CENP-E hemmingsmodell av musetestikler ved bruk av abdominalkirurgi og mikroinjeksjon av GSK923295. Abdominal kirurgi og testikulær injeksjonsmetode som brukes i denne studien har følgende fordeler. For det første er det ikke begrenset til musens alder. Eksperimenter kan utføre testikkelinjeksjon på et tidlig stadium, for eksempel hos 3 uker gamle eller yngre mus. For det andre har GSK923295 en spesifikk og utmerket hemmende effekt på CENP-E. For det tredje er den…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker alle medlemmer av Cytoskeleton Laboratory ved Fujian Medical University for nyttige diskusjoner. Vi takker Jun-Jin Lin ved Public Technology Service Center, Fujian Medical University for teknisk assistanse innen flowcytometri. Vi takker Ming-Xia Wu og Lin-Ying Zhou ved Electron Microscopy Lab of Public Technology Service Center, Fujian Medical University for teknisk assistanse i elektronmikroskopi. Vi takker Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke, og Jun Song ved Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences ved Fujian Medical University for deres støtte. Denne studien ble støttet av følgende tilskudd: National Natural Science Foundation of China (tilskuddsnummer 82001608), Natural Science Foundation of Fujian Province, Kina (tilskuddsnummer 2019J05071), Fujian Provincial Health Technology Project (tilskuddsnummer 2018-1-69), Startup Fund for Scientific Research, Fujian Medical University (stipendnummer 2017XQ1001), Fujian Medical University høyt nivå talenter vitenskapelig forskning oppstartsfinansieringsprosjekt (tilskuddsnummer XRCZX2017025) og forskningsprosjekt av nettbasert utdanning og undervisning av studenter i kinesisk medisin (stipendnummer B-YXC20200202-06).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1 ml Syringe Several commercial brands available Sterile.
1.5 mL Centrifuge tube Axygen MCT-150-C
50 mL Centrifuge Tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009164
tubulin rabbit polyclonal antibody Beyotime AF0001 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody Abcam ab267372 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody Sangon Biotech D110022 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody Abcam ab175191 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Adhesion microscope slides CITOTEST 188105
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody Beyotime A0423 Sencodary antibody. Use at 1:500.
Aluminium potassium sulphate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10001060
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 100092690
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Prevent photobleching of flourescent signals.
BD FACS Canto II BD Biosciences FACS Canto II
Bovine Serum Albumin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69003435
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Chloral hydrate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80037516
Citric acid Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 122670
Collagenase Sangon Biotech A004194-0100
Coverslips CITOTEST 10212020C 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm.
DAPI Beyotime C1006
Dye vat Several commercial brands available 91347802
Eosin Y, alcohol soluble Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71014460
Ether Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009318
Formaldehyde – aqueous solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10010018
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
Hematoxylin, anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71020784
ICR mouse Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Fluorescent image analysis.
Leica ultramicrotome Leica
Leica EM UC-7 ultramicrotome Leica EM UC7
Modfit MFLT32 Verity Software House For analysis of flow cytometry results.
Nail polish Several commercial brands available
Neutral gum Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10004160
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Picric acid Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd J60807
Rheodyne Sangon Biotech F519160-0001 10 μl rheodyne
Sliced paraffin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69019461
Sodium iodate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80117214
Surgical instruments Several commercial brands available For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min.
Transmission electron microscope FEI Tecnai G2
Trisodium citrate dihydrate Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 173970
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30188928 Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30189328 Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution.
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80096618
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10023418
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R. Evolutionary mysteries in meiosis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1706), 20160001 (2016).
  2. Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
  3. Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
  4. Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
  5. Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
  6. Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
  7. Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, 2953-2965 (2001).
  8. Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
  9. Bolcun-Filas, E., Handel, M. A. Meiosis: the chromosomal foundation of reproduction. Biology of Reproduction. 99 (1), 112-126 (2018).
  10. Lawrence, C. J., et al. A standardized kinesin nomenclature. The Journal of Cell Biology. 167 (1), 19-22 (2004).
  11. Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
  12. Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
  13. Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
  14. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  15. Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
  16. Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
  17. Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  18. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  19. She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25 (2020).
  20. Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417 (2009).
  21. Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
  22. Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
  23. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  24. Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T. Prospects for spermatogenesis in vitro. Theriogenology. 59 (1), 73-86 (2003).
  25. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  26. Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
  27. Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
  28. La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
  29. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  30. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  31. Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
  32. She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6 (2020).
  33. She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636 (2020).
  34. Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453 (2018).
  35. Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
  36. Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
  37. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  38. Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson’s Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
  39. Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431 (2021).
  40. Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
  41. Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961 (2020).
  42. Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Biologia do Desenvolvimento. 169 (2), 557-567 (1995).
  43. Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. Biologia do Desenvolvimento. 205 (1), 49-64 (1999).
  44. Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
  45. Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
  46. Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
  47. Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
  48. Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
  49. Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).

Tags

Keywords: MeiosisSpermatogenesisSpermatocytesCENP-EGSK923295ImmunofluorescenceFlow CytometryGene EditingMouse ModelMicrotome
check_url/pt/63271?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Xu, M., Yang, Y., Wei, Y., Zhang, J., Lin, X., Lin, X., Chen, H., She, Z. Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (178), e63271, doi:10.3791/63271 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image