JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Funktionell bedömning av kinesin-7 CENP-E i spermatocyter med användning av de vivo-hämning, immunofluorescens och flödescytometri

Published: December 28, 2021
doi:
10.3791/63271
, , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital,Affiliated Hospital of Fujian Medical University

Summary

Denna artikel rapporterar en de vivo-hämning av CENP-E genom bukkirurgi och testikelinjektion av GSK923295, en värdefull modell för manlig meiotisk delning. Med hjälp av immunofluorescens-, flödescytometri- och transmissionselektronmikroskopianalyser visar vi att CENP-E-hämning resulterar i kromosomfelinriktning och genominstabilitet i musspermatocyter.

Abstract

I eukaryoter är meios avgörande för genomstabilitet och genetisk mångfald vid sexuell reproduktion. Experimentella analyser av spermatocyter i testiklar är kritiska för undersökningar av spindelsammansättning och kromosomsegregering vid manlig meiotisk delning. Musspermatocyten är en idealisk modell för mekanistiska studier av meios, men effektiva metoder för analys av spermatocyter saknas. I denna artikel rapporteras en praktisk och effektiv metod för in vivo-hämning av kinesin-7 CENP-E i musspermatocyter. Ett detaljerat förfarande för testikelinjektion av en specifik hämmare GSK923295 genom bukkirurgi hos 3 veckor gamla möss presenteras. Vidare beskrivs här en serie protokoll för vävnadsinsamling och fixering, hematoxylin-eosinfärgning, immunofluorescens, flödescytometri och transmissionselektronmikroskopi. Här presenterar vi en in vivo-hämningsmodell via bukkirurgi och testikelinjektion, som kan vara en kraftfull teknik för att studera manlig meios. Vi visar också att CENP-E-hämning resulterar i kromosomfelinriktning och metafasstopp i primära spermatocyter under meios I. Vår de vivo-hämningsmetod kommer att underlätta meiosstudier, fungera som en användbar metod för genetiska modifieringar av manliga könslinjer och belysa framtida kliniska tillämpningar.

Introduction

Meios är en av de viktigaste, mycket styva, evolutionärt bevarade händelserna i eukaryota organismer och är avgörande för gametogenes, sexuell reproduktion, genomintegritet och genetisk mångfald 1,2,3. Hos däggdjur genomgår könscellerna två på varandra följande celldelningar, meios I och II, efter en enda omgång DNA-replikation. Till skillnad från systerkromatider vid mitos kopplas duplicerade homologa kromosomer ihop och separeras i två dotterceller under meios I 4,5. I meios II drar systerkromatider isär och separerar för att bilda haploida gameter utan DNA-replikation6. Fel i någon av de två meiotiska divisionerna, inklusive spindelmonteringsdefekter och kromosommissegregering, kan leda till förlust av könsceller, sterilitet eller aneuploidisyndrom 7,8,9.

Ackumulerande studier har visat att kinesinfamiljemotorer spelar en avgörande roll i regleringen av kromosomjustering och segregering, spindelmontering, cytokinese och cellcykelprogression i både mitotiska och meiotiska celler10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (centromerprotein E) är en plus-end-riktad kinetokormotor som krävs för kromosomkongress, kromosomtransport och inriktning och reglering av spindelmonteringskontrollpunkt i mitos 13,14,15,16,17,18. Under meios leder CENP-E-hämning av den specifika hämmaren GSK923295 till cellcykelstopp, kromosomfelinriktning, spindeldisorganisation och genominstabilitet i spermatogena celler19. Lokaliseringsmönstren och dynamiken hos CENP-E vid centromererna för delande spermatocyter indikerar att CENP-E interagerar med kinetokorproteiner för sekventiell sammansättning av centromerer under meios I20,21. I oocyter krävs CENP-E för kromosomjustering och slutförande av meios I13,22,23. Antikroppar eller morfolinoinjektion av CENP-E resulterar i feljusterade kromosomer, onormal kinetokororientering och meios I arresterar i både mus- och Drosophila-oocyter 23. Jämfört med de väsentliga rollerna för CENP-E i mitos är funktionerna och mekanismerna för CENP-E i meios fortfarande i stort sett okända. Detaljerade mekanismer för CENP-E i kromosomkongress och genomstabilitet i manliga meiotiska celler återstår att klargöra.

Spermatogenes är en komplex och långvarig fysiologisk process, som involverar sekventiell spermatogoniaproliferation, meios och spermiogenes. Därför är hela processen utomordentligt svår att reproducera in vitro hos däggdjur och andra arter24,25. Det är omöjligt att inducera spermatocytdifferentiering efter pachytenstadiet in vitro. Studier av manliga meiotiska delningar har i allmänhet begränsats till experimentella analyser av tidig meiotisk profas25,26. Trots många tekniska ansträngningar, inklusive kortvarig odling av spermatocyter27,28 och organodlingsmetoder25, finns det få effektiva metoder för att studera manlig meiotisk delning. Dessutom resulterar genetisk deletion av essentiella gener vanligtvis i utvecklingsstopp och embryonal dödlighet. Till exempel misslyckas musembryon som saknar CENP-E att implantera och kan inte utvecklas efter implantation29, vilket är ett hinder i mekanistiska studier av CENP-E vid meios. Sammantaget kan upprättandet av ett praktiskt och genomförbart system för att studera manlig meiotisk uppdelning i hög grad främja forskningsområdet meios.

Den lilla cellgenomsläppliga hämmaren är ett kraftfullt verktyg för att studera kinesinmotorer i celldelning och utvecklingsprocesser. Den allosteriska hämmaren, GSK923295, binder specifikt till CENP-E-motordomänen, blockerar frisättningen av ADP (adenosindifosfat) och stabiliserar slutligen interaktionerna mellan CENP-E och mikrotubuli30. I denna studie presenteras en in vivo inhibitionsmusmodell genom bukkirurgi och testikelinjektion av GSK923295. CENP-E-hämning resulterar i feljustering av kromosomer i metafas I av primära spermatocyter. Vidare leder CENP-E-hämning till meiotisk arrestering av spermatocyter och störning av spermatogenesen. En serie protokoll beskrivs för analys av spermatocyter och kan tillämpas för att observera meiotiska spindelmikrotubuli, homologa kromosomer och subcellulära organeller i spermatocyter. Vår de vivo-hämningsmetod är en effektiv metod för studier av meiotisk delning och spermatogenes.

Protocol

Alla djurförsök granskades och godkändes av Animal Care and Use Committee vid Fujian Medical University (protokollnummer SYXK 2016-0007). Alla musexperiment utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer för vård och användning av laboratoriedjur från National Institutes of Health (NIH-publikationer nummer 8023, reviderad 1978). 1. Konstruktion av GSK923295-medierade CENP-E-hämningsmusmodeller Sterilisera operationsinstrumenten vid 121 °C i 30 minuter. Bestr?…

Representative Results

Vi har framgångsrikt konstruerat en in vivo CENP-E-hämningsmodell av mustestiklar genom bukkirurgi och testikelinjektion av GSK92329519. De viktigaste tekniska stegen för denna metod visas i figur 1. Efter testikelinjektion av GSK923295 i 4 dagar skördades testiklarna för ytterligare analyser. I kontrollgruppen var den spermatogena vågen i seminiferous tubuli regelbunden och organiserad (figur 2A). I den GSK923295 gruppen f…

Discussion

I denna studie har vi etablerat en in vivo CENP-E-hämningsmodell av mustestiklar med hjälp av bukkirurgi och mikroinjektion av GSK923295. Bukkirurgi och testikelinjektionsmetod som används i denna studie har följande fördelar. För det första är det inte begränsat till mössens ålder. Experimenter kan utföra testikelinjektion i ett tidigt skede, till exempel vid 3 veckor gamla eller yngre möss. För det andra har GSK923295 en specifik och utmärkt hämmande effekt på CENP-E. För det tredje är denna…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar alla medlemmar i Cytoskeleton Laboratory vid Fujian Medical University för hjälpsamma diskussioner. Vi tackar Jun-Jin Lin på Public Technology Service Center, Fujian Medical University för teknisk hjälp inom flödescytometri. Vi tackar Ming-Xia Wu och Lin-Ying Zhou vid Electron Microscopy Lab of Public Technology Service Center, Fujian Medical University för teknisk hjälp inom elektronmikroskopi. Vi tackar Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke och Jun Song på Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences vid Fujian Medical University för deras stöd. Denna studie stöddes av följande bidrag: National Natural Science Foundation of China (bidragsnummer 82001608), Natural Science Foundation of Fujian-provinsen, Kina (bidragsnummer 2019J05071), Fujian Provincial Health Technology Project (bidragsnummer 2018-1-69), Startup Fund for Scientific Research, Fujian Medical University (bidragsnummer 2017XQ1001), Fujian Medical University high level talents scientific research start-up funding project (bidragsnummer XRCZX2017025) och forskningsprojekt av online-utbildning och undervisning av doktorander i kinesisk medicin (bidragsnummer B-YXC20200202-06).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1 ml Syringe Several commercial brands available Sterile.
1.5 mL Centrifuge tube Axygen MCT-150-C
50 mL Centrifuge Tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009164
tubulin rabbit polyclonal antibody Beyotime AF0001 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody Abcam ab267372 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody Sangon Biotech D110022 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody Abcam ab175191 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Adhesion microscope slides CITOTEST 188105
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody Beyotime A0423 Sencodary antibody. Use at 1:500.
Aluminium potassium sulphate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10001060
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 100092690
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Prevent photobleching of flourescent signals.
BD FACS Canto II BD Biosciences FACS Canto II
Bovine Serum Albumin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69003435
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Chloral hydrate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80037516
Citric acid Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 122670
Collagenase Sangon Biotech A004194-0100
Coverslips CITOTEST 10212020C 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm.
DAPI Beyotime C1006
Dye vat Several commercial brands available 91347802
Eosin Y, alcohol soluble Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71014460
Ether Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009318
Formaldehyde – aqueous solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10010018
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
Hematoxylin, anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71020784
ICR mouse Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Fluorescent image analysis.
Leica ultramicrotome Leica
Leica EM UC-7 ultramicrotome Leica EM UC7
Modfit MFLT32 Verity Software House For analysis of flow cytometry results.
Nail polish Several commercial brands available
Neutral gum Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10004160
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Picric acid Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd J60807
Rheodyne Sangon Biotech F519160-0001 10 μl rheodyne
Sliced paraffin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69019461
Sodium iodate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80117214
Surgical instruments Several commercial brands available For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min.
Transmission electron microscope FEI Tecnai G2
Trisodium citrate dihydrate Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 173970
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30188928 Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30189328 Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution.
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80096618
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10023418
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R. Evolutionary mysteries in meiosis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1706), 20160001 (2016).
  2. Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
  3. Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
  4. Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
  5. Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
  6. Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
  7. Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, 2953-2965 (2001).
  8. Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
  9. Bolcun-Filas, E., Handel, M. A. Meiosis: the chromosomal foundation of reproduction. Biology of Reproduction. 99 (1), 112-126 (2018).
  10. Lawrence, C. J., et al. A standardized kinesin nomenclature. The Journal of Cell Biology. 167 (1), 19-22 (2004).
  11. Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
  12. Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
  13. Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
  14. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  15. Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
  16. Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
  17. Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  18. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  19. She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25 (2020).
  20. Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417 (2009).
  21. Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
  22. Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
  23. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  24. Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T. Prospects for spermatogenesis in vitro. Theriogenology. 59 (1), 73-86 (2003).
  25. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  26. Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
  27. Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
  28. La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
  29. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  30. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  31. Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
  32. She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6 (2020).
  33. She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636 (2020).
  34. Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453 (2018).
  35. Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
  36. Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
  37. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  38. Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson’s Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
  39. Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431 (2021).
  40. Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
  41. Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961 (2020).
  42. Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Biologia do Desenvolvimento. 169 (2), 557-567 (1995).
  43. Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. Biologia do Desenvolvimento. 205 (1), 49-64 (1999).
  44. Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
  45. Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
  46. Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
  47. Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
  48. Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
  49. Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).

Tags

Keywords: MeiosisSpermatogenesisSpermatocytesCENP-EGSK923295ImmunofluorescenceFlow CytometryGene EditingMouse ModelMicrotome
check_url/pt/63271?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Xu, M., Yang, Y., Wei, Y., Zhang, J., Lin, X., Lin, X., Chen, H., She, Z. Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (178), e63271, doi:10.3791/63271 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image