Isolatie en karakterisering van intact fycobilisoom in cyanobacteriën
Summary
Het huidige protocol beschrijft de isolatie van fycobilisomen uit cyanobacteriën door centrifugering door middel van een discontinue sucrosedichtheidsgradiënt. De fracties van intacte fycobilisomen worden bevestigd door 77K fluorescerend emissiespectrum en SDS-PAGE-analyse. De resulterende fycobilisoomfracties zijn geschikt voor negatieve kleuring van TEM en massaspectrometrie-analyse.
Abstract
In cyanobacteriën is fycobilisoom een vitaal antenne-eiwitcomplex dat licht oogst en energie overbrengt naar fotosysteem I en II voor fotochemie. Het bestuderen van de structuur en samenstelling van fycobilisoom is van groot belang voor wetenschappers omdat het de evolutie en divergentie van fotosynthese in cyanobacteriën onthult. Dit protocol biedt een gedetailleerde en geoptimaliseerde methode om cyanobacteriële cellen tegen lage kosten te breken door een kralenklopper efficiënt. Het intacte fycobilisoom kan vervolgens uit het celextract worden geïsoleerd door sucrose gradiënt ultracentrifugatie. Deze methode heeft aangetoond geschikt te zijn voor zowel model- als niet-modelcyanobacteriën met verschillende celtypen. Een stapsgewijze procedure wordt ook aangeboden om de integriteit en eigenschap van fycobiliproteïnen te bevestigen door 77K fluorescentiespectroscopie en SDS-PAGE gekleurd door zinksulfaat en Coomassie Blue. Het geïsoleerde fycobilisoom kan ook worden onderworpen aan verdere structurele en compositorische analyses. Over het algemeen biedt dit protocol een nuttige startgids waarmee onderzoekers die niet bekend zijn met cyanobacteriën snel intact fycobilisoom kunnen isoleren en karakteriseren.
Introduction
Fycobilisoom (PBS) is een enorm in water oplosbaar pigmenteiwitcomplex dat zich hecht aan de cytoplasmatische kant van de fotosystemen in de thylakoïde membranen van cyanobacteriën1. PBS bestaat voornamelijk uit gekleurde fycobiliproteïnen en kleurloze linkereiwitten1,2. De fycobiliproteïnen kunnen worden onderverdeeld in vier hoofdgroepen: phycoerythrin, phycoerythrocyanine, phycocyanine en allophycocyanin3. De vier belangrijkste groepen absorberen verschillende golflengten van lichtenergie in het bereik van 490-650 nm, die chlorofylen inefficiënt absorbeerden3. De PBS kan dienen als een lichtoogstantenne voor het verzamelen van lichtenergie en deze te leveren aan Photosystem II en I4.
De structuur en samenstelling van PBS verschillen van soort tot soort. Gezamenlijk zijn drie vormen van fycobilisoom (hemidiscodiaal, bundelvormig en staafvormig) geïdentificeerd in verschillende cyanobacteriële soorten5. Zelfs bij dezelfde soort verandert de samenstelling van PBS als reactie op de omgeving, zoals lichtkwaliteit en uitputting van voedingsstoffen6,7,8,9,10,11. Daarom is de experimentele procedure om PBS te isoleren van cyanobacteriën van groot belang geweest bij het bestuderen van PBS12. Gedurende meerdere decennia hebben veel verschillende protocollen PBS geïsoleerd en de structuur, samenstelling en functie ervan geanalyseerd6,7,8,12,13,14,15,16,17. De grote verscheidenheid aan methoden voor PBS-isolatie biedt inderdaad flexibiliteit bij het isoleren van het complex in verschillende soorten met verschillende reagentia en instrumenten. Het maakt het echter ook moeilijker om een geschikt protocol te kiezen voor wetenschappers die niet bekend zijn met cyanobacteriën en PBS. Daarom wordt in dit werk een gegeneraliseerd en eenvoudig protocol ontwikkeld voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het starten van PBS-isolatie van cyanobacteriën.
De methoden voor het isoleren van PBS uit eerdere publicaties worden hier samengevat. Omdat PBS een in water oplosbaar eiwitcomplex is en gemakkelijk kan worden gedissocieerd, is een fosfaatbuffer met hoge ionische sterkte nodig om PBS tijdens extractie te stabiliseren18. Verschillende onderzoeksartikelen die methoden beschrijven voor de isolatie van PBS van cyanobacterium zijn in het verleden gepubliceerd. De meeste methoden vereisen een hoge concentratie fosfaatbuffer8,14,15,18,19. De procedures voor mechanische verstoring van de cellen variëren echter, zoals glasparels-ondersteunde extractie, ultrasoonapparaat20 en Franse pers6,8,14. Verschillende fycobiliproteïnen kunnen worden verkregen door precipitatie met ammoniumsulfaat20 en gezuiverd door HPLC21 of een chromatografische kolom22. Aan de andere kant kan intact PBS gemakkelijk worden geïsoleerd door sucrosedichtheidsgradiënt ultracentrifugatie6,8,15.
In dit protocol werden één modelcyanobacterie en één niet-model cyanobacterie gebruikt als materialen voor PBS-isolatie. Het gaat om model eencellige glucosetolerante Synechocystis sp. PCC 6803 (hierna Syn6803) en niet-model filamenteuze Leptolyngbya sp. JSC-1 (hierna JSC-1), respectievelijk7,23,24. Het protocol begint met verstoring van de eencellige en filamenteuze cyanobacteriën in een fosfaatbuffer met hoge ionische sterkte. Na lysis worden de supernatanten verzameld door centrifugeren en vervolgens behandeld met een niet-ionisch reinigingsmiddel (Triton X-100) om de in water oplosbare eiwitten uit de thylakoïde membranen op te lossen. De totale in water oplosbare eiwitten worden toegepast op een discontinue sucrosedichtheidsgradiënt om de PBS te fractioneren. De discontinue sucrosegradiënt in dit protocol bestaat uit vier sucrose-oplossingen en verdeelt de intacte PBS in de laagste fracties van sucroselaag25. De integriteit van PBS kan worden geanalyseerd door SDS-PAGE, zinkkleuring en 77K fluorescentiespectroscopie6,7,8,26. Deze methode is geschikt voor wetenschappers die intact PBS willen isoleren van cyanobacteriën en de spectrale, structurele en compositorische eigenschappen ervan willen bestuderen.
Er zijn verschillende voordelen van dit protocol. (1) Deze methode is gestandaardiseerd en kan worden gebruikt voor het isoleren van intact PBS van zowel eencellige als filamenteuze cyanobacteriën. De meeste artikelen beschrijven de methode die werd toegepast in één type cyanobacteriën4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Deze methode wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur, aangezien PBS dissocieert bij lage temperatuur19,27. (3) Deze methode beschrijft het gebruik van een kralenklopper om de cellen te verstoren; daarom is het goedkoper en veiliger dan hogedruk Franse pers en mogelijke gehoorschade door sonicator in andere methoden8,13,14,20. (4) Deze methode isoleert intact PBS door middel van ultracentrifugatie van sucrosegradiënt. Op deze manier kan intact PBS met verschillende maten en gedeeltelijk gedissocieerde PBS worden gescheiden op basis van sucroseconcentratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een eenvoudige en standaardmethode voor het isoleren van intacte PBS in twee soorten cyanobacteriën, eencellig model Syn6803 en filamenteuze niet-model JSC-1. De kritische stappen van het protocol zijn celhomogenisatie en ultracentrifugatie op een discontinue dichtheidsgradiënt van sucrose. Over het algemeen is de verstoring van filamenteuze cellen gecompliceerder dan eencellige cellen. Het verhogen van de hoeveelheid uitgangsmateriaal (het natte gewicht van de celkorrel) en de herhaling van het…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University voor het handige gebruik van de ultracentrifuge. De cyanobacteriële stammen Synechocystis sp. PCC 6803 en Leptolyngbya sp. JSC-1 werden geschonken door respectievelijk Dr. Chu, Hsiu-An aan de Academia Sinica, Taiwan, en Dr. Donald A. Bryant aan de Pennsylvania State University, VS. Dit werk werd gefinancierd door het Ministerie van Wetenschap en Technologie (Taiwan) (109-2636-B-002-013- en 110-2628-B-002-065-) en het Ministerie van Onderwijs (Taiwan) Yushan Young Scholar Program (109V1102 en 110V1102).
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
Referências
- Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model. Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).
- Glazer, A. N. Phycobilisomes: Structure and dynamics. Annual Review of Microbiology. 36, 173-198 (1982).
- Glazer, A. N. Light harvesting by phycobilisomes. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 14 (1), 47-77 (1985).
- Liu, H., et al. Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria. Science. 342 (6162), 1104 (2013).
- Bryant, D. A., Canniffe, D. P. How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).
- Hirose, Y., et al. Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria. Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).
- Gan, F., et al. Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light. Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).
- Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light. Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).
- Ho, M. Y., et al. Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).
- Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis. Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).
- Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions. Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).
- Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp. Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).
- Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light. Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).
- Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes. Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).
- Zhang, J., et al. Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica. Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).
- Li, Y., et al. Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).
- Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach. Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).
- Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301. Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).
- Gantt, E., Lipschultz, C. A., Grabowski, J., Zimmerman, B. K. Phycobilisomes from blue-green and red algae: Isolation criteria and dissociation characteristics. Plant Physiology. 63 (4), 615-620 (1979).
- Patel, A., Mishra, S., Pawar, R., Ghosh, P. K. Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat. Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).
- Zolla, L., Bianchetti, M. High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins. Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).
- Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India. Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).
- Williams, J. G. K. . Methods in Enzymology. , 766-778 (1988).
- Brown Igor, I., et al. Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits. Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).
- Wang, L., et al. Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata. PLoS One. 9 (2), 87833 (2014).
- Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).
- Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).
- Dubbs, J. M., Bryant, D. A. Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409. Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).
- Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002. Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).
- Zhang, S., Bryant, D. A. Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212. Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).
- Huang, J. Y., et al. Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Bioquímica. 55 (15), 2214-2226 (2016).
- Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris – A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f. Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga. Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).
- Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).
- Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).
- Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna. Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).
