Isolierung und Charakterisierung intakter Phycobilisomen in Cyanobakterien
Summary
Das aktuelle Protokoll beschreibt die Isolierung von Phycobilisomen aus Cyanobakterien durch Zentrifugation durch einen diskontinuierlichen Saccharosedichtegradienten. Die Fraktionen intakter Phycobilisomen werden durch 77K-Fluoreszenzemissionsspektrum und SDS-PAGE-Analyse bestätigt. Die resultierenden Phycobilisom-Fraktionen eignen sich für die negative Färbung von TEM und die massenspektrometrische Analyse.
Abstract
In Cyanobakterien ist das Phycobilisom ein lebenswichtiger Antennenproteinkomplex, der Licht erntet und Energie an das Photosystem I und II für die Photochemie überträgt. Die Untersuchung der Struktur und Zusammensetzung von Phycobilisom ist für Wissenschaftler von großem Interesse, da sie die Evolution und Divergenz der Photosynthese in Cyanobakterien aufdeckt. Dieses Protokoll bietet eine detaillierte und optimierte Methode, um Cyanobakterienzellen kostengünstig durch einen Perlenschläger effizient zu brechen. Das intakte Phycobilisom kann dann aus dem Zellextrakt durch Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation isoliert werden. Diese Methode hat gezeigt, dass sie sowohl für Modell- als auch für Nicht-Modell-Cyanobakterien mit unterschiedlichen Zelltypen geeignet ist. Ein schrittweises Verfahren wird auch bereitgestellt, um die Integrität und Eigenschaft von Phycobiliproteinen durch 77K-Fluoreszenzspektroskopie und SDS-PAGE, die mit Zinksulfat und Coomassie Blue gefärbt wurden, zu bestätigen. Das isolierte Phycobilisom kann auch weiteren Struktur- und Zusammensetzungsanalysen unterzogen werden. Insgesamt bietet dieses Protokoll einen hilfreichen Startleitfaden, der es Forschern, die mit Cyanobakterien nicht vertraut sind, ermöglicht, intakte Phycobilisomen schnell zu isolieren und zu charakterisieren.
Introduction
Phycobilisom (PBS) ist ein riesiger wasserlöslicher Pigment-Protein-Komplex, der sich an die zytoplasmatische Seite der Photosysteme in den Thylakoidmembranen von Cyanobakterien bindet1. PBS besteht hauptsächlich aus farbigen Phycobiliproteinen und farblosen Linkerproteinen1,2. Die Phycobiliproteine können in vier Hauptgruppen unterteilt werden: Phycoerythrin, Phycoerythrocyanin, Phycocyanin und Allophycocyanin3. Die vier Hauptgruppen absorbieren unterschiedliche Wellenlängen der Lichtenergie im Bereich von 490-650 nm, die Chlorophylle ineffizient absorbierten3. Das PBS kann als Lichtsammelantenne dienen, um Lichtenergie zu sammeln und an Photosystem II und I4 abzugeben.
Die Struktur und Zusammensetzung von PBS variiert von Art zu Art. Insgesamt wurden drei Formen von Phycobilisomen (hemidiscodial, bündelförmig und stäbchenförmig) in verschiedenen Cyanobakterienspezies identifiziert5. Selbst bei den gleichen Arten ändert sich die Zusammensetzung von PBS als Reaktion auf die Umwelt, wie Lichtqualität und Nährstoffmangel6,7,8,9,10,11. Daher war das experimentelle Verfahren zur Isolierung von PBS aus Cyanobakterien maßgeblich an der Untersuchung von PBS12 beteiligt. Über mehrere Jahrzehnte haben viele verschiedene Protokolle PBS isoliert und seine Struktur, Zusammensetzung und Funktion analysiert6,7,8,12,13,14,15,16,17. Die große Vielfalt an Methoden zur PBS-Isolierung bietet in der Tat Flexibilität bei der Isolierung des Komplexes in verschiedenen Spezies mit unterschiedlichen Reagenzien und Instrumenten. Es erschwert jedoch auch die Auswahl eines geeigneten Protokolls für Wissenschaftler, die mit Cyanobakterien und PBS nicht vertraut sind. Daher wird in dieser Arbeit ein verallgemeinertes und einfaches Protokoll für diejenigen entwickelt, die daran interessiert sind, die PBS-Isolierung aus Cyanobakterien zu beginnen.
Die Methoden zur Isolierung von PBS aus früheren Publikationen sind hier zusammengefasst. Da PBS ein wasserlöslicher Proteinkomplex ist und leicht dissoziiert werden kann, ist ein hochionischer Phosphatpuffer erforderlich, um PBS während der Extraktion zu stabilisieren18. Mehrere Forschungsartikel, die Methoden zur Isolierung von PBS aus Cyanobakterien beschreiben, wurden in der Vergangenheit veröffentlicht. Die meisten Methoden erfordern eine hohe Konzentration an Phosphatpuffer8,14,15,18,19. Die Verfahren zur mechanischen Störung der Zellen variieren jedoch, wie z. B. glasperlengestützte Extraktion, Beschallung20 und French Press6,8,14. Verschiedene Phycobiliproteine können durch Fällung mit Ammoniumsulfat20 gewonnen und mittels HPLC21 oder einer chromatographischen Säule gereinigt werden22. Auf der anderen Seite kann intaktes PBS leicht durch Saccharosedichtegradienten-Ultrazentrifugation isoliert werden6,8,15.
In diesem Protokoll wurden ein Modellcyanobakterium und ein Nicht-Modell-Cyanobakterium als Materialien für die PBS-Isolierung verwendet. Es handelt sich um einzellige glucosetolerante Synechocystis sp. PCC 6803 (im Folgenden Syn6803) und nicht-modellartige filamentöse Leptolyngbya sp. JSC-1 (im Folgenden JSC-1) bzw. 7,23,24. Das Protokoll beginnt mit dem Aufbrechen der einzelligen und filamentösen Cyanobakterien in einem hochionischen Phosphatpuffer. Nach der Lyse werden die Überstände durch Zentrifugation gesammelt und dann mit einem nichtionischen Reinigungsmittel (Triton X-100) behandelt, um die wasserlöslichen Proteine aus den Thylakoidmembranen zu lösen. Die gesamten wasserlöslichen Proteine werden auf einen diskontinuierlichen Saccharosedichtegradienten aufgetragen, um das PBS zu fraktionieren. Der diskontinuierliche Saccharosegradient in diesem Protokoll besteht aus vier Saccharoselösungen und teilt das intakte PBS in die niedrigsten Anteile der Saccharoseschicht auf25. Die Integrität von PBS kann durch SDS-PAGE, Zinkfärbung und 77K-Fluoreszenzspektroskopie6,7,8,26 analysiert werden. Diese Methode eignet sich für Wissenschaftler, die intaktes PBS aus Cyanobakterien isolieren und seine spektralen, strukturellen und kompositorischen Eigenschaften untersuchen wollen.
Es gibt mehrere Vorteile dieses Protokolls. (1) Diese Methode ist standardisiert und kann zur Isolierung von intaktem PBS sowohl aus einzelligen als auch aus filamentösen Cyanobakterien verwendet werden. Die meisten Artikel beschreiben die Methode, die in einer der beiden Arten von Cyanobakterien angewendet wurde4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Diese Methode wird bei Raumtemperatur durchgeführt, da PBS bei niedriger Temperatur dissoziiert19,27. (3) Diese Methode beschreibt die Verwendung eines Perlenschlägers, um die Zellen zu stören; Daher ist es billiger und sicherer als Hochdruck-French-Presse und mögliche Hörschäden durch Ultraschall in anderen Methoden8,13,14,20. (4) Diese Methode isoliert intaktes PBS durch Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation. Auf diese Weise können intaktes PBS mit unterschiedlichen Größen und teilweise dissoziiertes PBS basierend auf der Saccharosekonzentration getrennt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und Standardmethode zur Isolierung von intaktem PBS in zwei Arten von Cyanobakterien, dem einzelligen Modell Syn6803 und dem fadenförmigen Nicht-Modell JSC-1. Die kritischen Schritte des Protokolls sind die Zellhomogenisierung und die Ultrazentrifugation auf einem diskontinuierlichen Dichtegradienten von Saccharose. Im Allgemeinen ist die Störung von filamentösen Zellen komplizierter als einzellige. Die Erhöhung der Menge des Ausgangsmaterials (das Nassgewicht des Zellpellets…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University für den bequemen Einsatz der Ultrazentrifuge. Die Cyanobakterienstämme Synechocystis sp. PCC 6803 und Leptolyngbya sp. JSC-1 wurden von Dr. Chu, Hsiu-An an der Academia Sinica, Taiwan, bzw. Dr. Donald A. Bryant an der Pennsylvania State University, USA, geschenkt. Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie (Taiwan) (109-2636-B-002-013- und 110-2628-B-002-065-) und dem Yushan Young Scholar Program des Bildungsministeriums (Taiwan) (109V1102 und 110V1102) finanziert.
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
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