בידוד ואפיון של פיקוביליזום שלם בציאנובקטריה
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מפרט את הבידוד של phycobililisomes מציאנובקטריה על ידי צנטריפוגציה באמצעות שיפוע צפיפות סוכרוז בלתי פוסק. השברים של phycobilisomes שלמים מאושרים על ידי ספקטרום פליטה פלואורסצנטי 77K וניתוח SDS-PAGE. שברי הפיזיקוביליוזום המתקבלים מתאימים להכתמה שלילית של TEM וניתוח ספקטרומטריית מסה.
Abstract
ב ציאנובקטריה, phycobilisome הוא קומפלקס חלבון אנטנה חיוני אשר קוצר אור ומעביר אנרגיה למערכות פוטו-מערכת I ו- II עבור פוטוכימיה. לימוד המבנה וההרכב של phycobilisome הוא עניין רב למדענים כי זה חושף את האבולוציה ואת הסטייה של פוטוסינתזה ציאנובקטריה. פרוטוקול זה מספק שיטה מפורטת וממוטבת לשבירת תאים ציאנובקטריאליים בעלות נמוכה על ידי מקצף חרוזים ביעילות. לאחר מכן ניתן לבודד את הפיזיקוביליוזום השלם מתמצית התא על ידי אולטרה-צנטריפוגציה הדרגתית של סוכרוז. שיטה זו הוכיחה שהיא מתאימה הן לדגם והן לציאנובקטריה שאינה מודל עם סוגי תאים שונים. הליך שלב אחר שלב מסופק גם כדי לאשר את השלמות והרכוש של phycobiliproteins על ידי ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות 77K ו- SDS-PAGE מוכתם על ידי אבץ גופרתי וכחול קומאסי. phycobilisome מבודד יכול גם להיות נתון ניתוחים מבניים נוספים קומפוזיציה. בסך הכל, פרוטוקול זה מספק מדריך התחלה מועיל המאפשר לחוקרים שאינם מכירים ציאנובקטריה לבודד ולאפיין במהירות פיקוביליזום שלם.
Introduction
Phycobilisome (PBS) הוא קומפלקס ענק של חלבון פיגמנט מסיס במים המתחבר לצד הציטופלסמי של מערכות הפוטו-מערכות בממברנות התילקואידיות של ציאנובקטריה1. PBS מורכב בעיקר מפיקוביליפרוטאינים צבעוניים וחלבוני מקשר חסרי צבע1,2. את phycobiliproteins ניתן לחלק לארבע קבוצות עיקריות: phycoeryththrin, phycoerythrocyanin, phycocyanin, ו allophycocyanin3. ארבע הקבוצות העיקריות סופגות אורכי גל שונים של אנרגיית אור בטווח של 490-650 ננומטר, אשר כלורופילים ספגו בצורה לא יעילה3. ה-PBS יכול לשמש כאנטנה לקצירת אור לאיסוף אנרגיית אור ולהעברתה ל-Photosystem II ו-I4.
המבנה וההרכב של PBS משתנים ממינים למינים. באופן קולקטיבי, שלוש צורות של phycobilisome (hemididial, בצורת צרור, בצורת מוט) זוהו במינים ציאנובקטריאליים שונים5. אפילו באותם מינים, הרכב ה-PBS משתנה בתגובה לסביבה, כגון איכות האור והדלדול התזונתי6,7,8,9,10,10,11. לכן, ההליך הניסיוני לבודד PBS מציאנובקטריה היה אינסטרומנטלי בחקר PBS12. במשך כמה עשורים, פרוטוקולים רבים ושונים בודדו את PBS וניתחו את המבנה, ההרכב והתפקוד שלו6,7,8,12,13,14,15,16,17. המגוון הרחב של שיטות לבידוד PBS אכן מספק גמישות בבידוד המתחם במינים שונים עם ריאגנטים ומכשירים שונים. עם זאת, זה גם עושה בחירת פרוטוקול מתאים קשה יותר עבור מדענים שאינם מכירים עם ציאנובקטריה ו- PBS. לכן, פרוטוקול כללי ופשוט מפותח בעבודה זו עבור אלה המעוניינים להתחיל בידוד PBS מן ציאנובקטריה.
השיטות לבידוד PBS מפרסומים קודמים מסוכמות כאן. מאז PBS הוא קומפלקס חלבון מסיס במים והוא מנותק בקלות, מאגר פוספט כוח יוני גבוה נדרש כדי לייצב PBS במהלך החילוץ18. מספר מאמרי מחקר המתארים שיטות לבידוד PBS מציאנובקטריום פורסמו בעבר. רוב השיטות דורשות ריכוז גבוה של מאגר פוספט8,14,15,18,19. עם זאת, ההליכים לשיבוש מכני של התאים משתנים, כגון מיצוי בסיוע חרוזי זכוכית, sonication20, ועיתונות צרפתית 6,8,14. phycobiliproteins שונים ניתן להשיג על ידי משקעים עם אמוניום סולפט20 ומטוהר על ידי HPLC21 או טור כרומטוגרפי22. מצד שני, PBS שלם יכול להיות מבודד בקלות על ידי צפיפות סוכרוז שיפוע ultracentrifugation6,8,15.
בפרוטוקול זה, ציאנובקטריום מודל אחד וציאנובקטריום אחד שאינו מודל שימשו כחומרים לבידוד PBS. הם מודל חד תאי גלוקוז סובלני Synechocystis sp. PCC 6803 (להלן Syn6803) ולא מודל חוט Leptolyngbya sp. JSC-1 (להלן JSC-1), בהתאמה 7,23,24. הפרוטוקול מתחיל על ידי שיבוש של ציאנובקטריה חד-תאית ונימה במאגר פוספט בעל חוזק יוני גבוה. לאחר תמוגה, supernatants נאספים על ידי צנטריפוגה ולאחר מכן מטופלים עם חומר ניקוי לא יוני (טריטון X-100) כדי solubilize חלבונים מסיסים במים מן הקרומים thylakoid. סך החלבונים המסיסים במים מוחלים על שיפוע צפיפות סוכרוז בלתי פוסק כדי לחלק את ה- PBS. שיפוע הסוכרוז הבלתי פוסק בפרוטוקול זה מורכב מארבעה פתרונות סוכרוז ומחיצות PBS שלם בשברים הנמוכים ביותר של שכבת סוכרוז25. ניתן לנתח את השלמות של PBS על ידי SDS-PAGE, כתמי אבץ, ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית 77K6,7,8,26. שיטה זו מתאימה למדענים שמטרתם לבודד PBS שלם מציאנובקטריה ולחקור את תכונותיו הספקטרליות, המבניות וההרכביות.
ישנם מספר יתרונות של פרוטוקול זה. (1) שיטה זו מתוקננת וניתן להשתמש בה לבידוד PBS שלם הן מציאנובקטריה חד-תאית והן מציאנובקטריה נימית. רוב המאמרים מתארים את השיטה שחלה בכל סוג אחד של ציאנובקטריה4,7,8,12,13,14,16,18. (2) שיטה זו מבוצעת בטמפרטורת החדר, כאשר PBS מתנתק בטמפרטורה נמוכה19,27. (3) שיטה זו מתארת שימוש במקצף חרוזים כדי לשבש את התאים; לכן, זה זול ובטוח יותר מאשר עיתונות צרפתית בלחץ גבוה ונזק שמיעה אפשרי מ sonicator בשיטות אחרות8,13,14,20. (4) שיטה זו מבודדת PBS שלם על ידי צנטריפוגה אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית סוכרוז. בדרך זו, PBS שלם עם גדלים שונים PBS מנותק חלקית ניתן להפריד בהתבסס על ריכוז סוכרוז.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וסטנדרטית לבידוד PBS שלם בשני סוגים של ציאנובקטריה, דגם חד-תאי Syn6803, ו- JSC-1 שאינו דגם סיב. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול הם הומוגניזציה של תאים ו ultracentrifugation על שיפוע צפיפות רציפה של סוכרוז. בדרך כלל, ההפרעה של תאים נימיים היא מסובכת יותר מאשר אלה חד תאיים. הגדלת כמות ה…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לטכנולוגיה קומונס, המכללה למדעי החיים, אוניברסיטת טייוואן הלאומית על השימוש הנוח של ultracentrifuge. הזנים הציאנובקטריאליים Synechocystis sp. PCC 6803 ו Leptolyngbya sp. JSC-1 היה מחונן ד”ר צ’ו, סיו-אן באקדמיה סיניקה, טייוואן, וד”ר דונלד א בראיינט באוניברסיטת מדינת פנסילבניה, ארה”ב, בהתאמה. עבודה זו מומנה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה (טייוואן) (109-2636-B-002-013- ו-110-2628-B-002-065-) ומשרד החינוך (טייוואן) תוכנית המחקר הצעיר של יושן (109V1102 ו-110V1102).
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
Referências
- Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model. Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).
- Glazer, A. N. Phycobilisomes: Structure and dynamics. Annual Review of Microbiology. 36, 173-198 (1982).
- Glazer, A. N. Light harvesting by phycobilisomes. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 14 (1), 47-77 (1985).
- Liu, H., et al. Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria. Science. 342 (6162), 1104 (2013).
- Bryant, D. A., Canniffe, D. P. How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).
- Hirose, Y., et al. Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria. Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).
- Gan, F., et al. Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light. Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).
- Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light. Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).
- Ho, M. Y., et al. Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).
- Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis. Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).
- Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions. Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).
- Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp. Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).
- Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light. Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).
- Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes. Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).
- Zhang, J., et al. Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica. Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).
- Li, Y., et al. Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).
- Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach. Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).
- Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301. Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).
- Gantt, E., Lipschultz, C. A., Grabowski, J., Zimmerman, B. K. Phycobilisomes from blue-green and red algae: Isolation criteria and dissociation characteristics. Plant Physiology. 63 (4), 615-620 (1979).
- Patel, A., Mishra, S., Pawar, R., Ghosh, P. K. Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat. Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).
- Zolla, L., Bianchetti, M. High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins. Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).
- Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India. Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).
- Williams, J. G. K. . Methods in Enzymology. , 766-778 (1988).
- Brown Igor, I., et al. Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits. Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).
- Wang, L., et al. Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata. PLoS One. 9 (2), 87833 (2014).
- Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).
- Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).
- Dubbs, J. M., Bryant, D. A. Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409. Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).
- Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002. Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).
- Zhang, S., Bryant, D. A. Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212. Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).
- Huang, J. Y., et al. Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Bioquímica. 55 (15), 2214-2226 (2016).
- Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris – A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f. Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga. Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).
- Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).
- Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).
- Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna. Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).
