시아노박테리아의 피코빌리좀의 격리 및 특성화
Summary
현재 프로토콜은 불연속 자당 밀도 그라데이션을 통해 원심분리에 의한 시아노박테리아로부터의 피코빌리좀의 분리를 자세히 설명합니다. 그대로 피코빌리좀의 분획은 77K 형광 스펙트럼 및 SDS-PAGE 분석에 의해 확인된다. 결과 물리경분획은 TEM 및 질량 분광법 분석의 음수 염색에 적합합니다.
Abstract
시아노박테리아에서 피코빌리솜은 빛을 수확하고 광화학을 위해 광시스템 I와 II로 에너지를 전달하는 중요한 안테나 단백질 복합체입니다. 식물성 생물의 구조와 구성을 연구하는 것은 시아노 박테리아에서 광합성의 진화와 차이를 드러내기 때문에 과학자들에게 큰 관심사입니다. 이 프로토콜은 비드 비터에 의해 저렴한 비용으로 시아노균 세포를 분해하는 상세하고 최적화된 방법을 제공합니다. 그대로 피코빌리솜은 자당 그라데이션 초원심분리에 의해 세포 추출물로부터 분리될 수 있다. 이 방법은 다른 세포 모형을 가진 모형 및 비 모형 시아노박테리아 둘 다에 적합한 다는 것을 보여주었습니다. 또한 77K 형광 분광기 및 아연 황산염 및 쿠마시 블루에 의해 얼룩진 SDS-PAGE에 의해 물리 코빌리단백질의 무결성과 특성을 확인하기 위한 단계별 절차가 제공됩니다. 격리된 피코빌리솜은 또한 추가 구조 및 조성 분석을 실시할 수 있다. 전반적으로,이 프로토콜은 치아 노 박테리아에 익숙하지 않은 연구원이 신속하게 분리하고 그대로 피코빌리솜을 특성화 할 수있는 유용한 시작 가이드를 제공합니다.
Introduction
Phycobilisome (PBS)는 시아노 박테리아1의 틸라코이드 막에서 광시스템의 세포질 측에 부착하는 거대한 수용성 안료 단백질 복합체입니다. PBS는 주로 유색 물리 단백질과 무색 링커 단백질1,2로 구성됩니다. 물리코빌리단백질은 물리에리스린, 피코에리스로시아닌, 피코시아닌 및 동종코시아니닌3의 4가지 주요 그룹으로 나눌 수 있습니다. 4개의 주요 단은 엽록소가 비효율적으로 흡수한 490-650 nm 범위에서 다른 광에너지를 흡수합니다3. PBS는 광 에너지를 수집하고 광시스템 II 및 I4에 전달하기 위한 광 수확 안테나 역할을 할 수 있습니다.
PBS의 구조와 구성은 종마다 다릅니다. 전체적으로, 피코빌리솜의 세 가지 모양 (헤미디스탈, 번들 모양 및 막대 모양)은 다른 시아노박테리아 종5에서 확인되었습니다. 같은 종에서도 PBS의 조성은 광질 및 영양 고갈과 같은 환경에 반응하여 변화합니다6,7,8,9,10,11. 따라서, 시아노박테리아로부터 PBS를 분리하는 실험 절차는 PBS12를 공부하는 데 중요한 역할을 해왔다. 수십 년 동안 많은 다른 프로토콜은 PBS를 격리하고 그 구조, 구성 및 기능을 분석6,7,8,12,13,14,15,16,17. PBS 절연을 위한 다양한 방법은 실제로 다른 시약 및 계측기로 다른 종의 복합체를 분리하는 유연성을 제공합니다. 그러나, 그것은 또한 시아노 박테리아와 PBS에 익숙하지 않은 과학자에 대 한 적합 한 프로토콜을 선택 하 여 더 어렵게. 따라서, 일반화되고 간단한 프로토콜은 시아노박테리아에서 PBS 격리를 시작하는 데 관심이있는 사람들을 위해이 작품에서 개발된다.
이전 간행물에서 PBS를 격리하는 방법은 여기에 요약되어 있습니다. PBS는 수용성 단백질 복합체이며 쉽게 해리되기 때문에 추출 시 PBS를 안정화하기 위해서는 이온 강도가 높은 인산염 버퍼가 필요합니다18. 시아노박테리움에서 PBS의 격리를 위한 방법을 설명하는 몇몇 연구 기사는 과거에 간행되었습니다. 대부분의 방법은 인산염 완충제의 고농도를 필요로8,14,15,18,19. 그러나, 세포의 기계적 중단을 위한 절차는 유리 구슬 보조 추출, 초음파 처리20 및 프랑스 프레스6,8,14와 같이 변화합니다. 상이한 물리코빌리단백질은 황산암모늄을 함유한 침전을 통해 얻어지고 HPLC21 또는 크로마토그래피 컬럼22에 의해 정제될 수 있다. 한편, 그대로 PBS는 자당밀도 그라데이션 6,8,15에 의해 쉽게 분리될 수 있다.
이 프로토콜에서, 1개의 모형 cyanobacterium 및 1개의 비 모형 cyanobacterium는 PBS 격리를 위한 물질로 이용되었습니다. 이들은 모델 단세포 포도당 내성 Synechocystis sp. PCC 6803 (이하 Syn6803) 및 비 모델 필라멘트 렙토렝비아 sp. JSC-1 (이하 JSC-1), 각각 7,23,24이다. 프로토콜은 고온 강도 인산염 버퍼에서 단세포 및 필라멘트 시아노박테리아의 중단에 의해 시작됩니다. 용해 후, 슈퍼나탕은 원심분리에 의해 채취한 다음, 틸라코이드 막으로부터 수용성 단백질을 용해시키기 위해 니오니안 세제(Triton X-100)로 처리됩니다. 총 수용성 단백질은 PBS를 분별하기 위해 불연속 자당 밀도 그라데이션에 적용됩니다. 이 프로토콜의 불연속 자당 그라데이션은 4개의 자당 솔루션으로 구성되며, 자당 계층25의 가장 낮은 분수에서 그대로 PBS를 분할합니다. PBS의 무결성은 SDS-PAGE, 아연 염색 및 77K 형광 분광기6,7,8,26에 의해 분석될 수 있다. 이 방법은 시아노박테리아에서 온전한 PBS를 분리하고 스펙트럼, 구조 및 조성 특성을 연구하는 것을 목표로 하는 과학자들에게 적합합니다.
이 프로토콜에는 몇 가지 장점이 있습니다. (1) 이 방법은 표준화되어 단세포 및 필라멘트 시아노박테리아 모두에서 온전한 PBS를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 대부분의 논문은 시아노박테리아4,7,8,12,13,14,16,18의 한 가지 유형에 적용되는 방법을 설명합니다. (2) PBS가 저온19,27에서 해리됨에 따라 이 방법은 실온에서 수행됩니다. (3) 이 방법은 비드 비터를 사용하여 세포를 방해하는 방법을 설명합니다. 따라서, 그것은 고압 프랑스어 프레스보다 저렴하고 안전하고 다른 방법으로 초음파 처리기에서 가능한 청력 손상8,13,14,20. (4) 이 방법은 자당 그라데이션 초원심분리에 의해 그대로 PBS를 분리한다. 이러한 방식으로, 크기가 다르고 부분적으로 해리된 PBS를 가진 온전한 PBS는 자당 농도에 따라 분리될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 시아노박테리아, 단세포 모델 Syn6803 및 필라멘트 비모델 JSC-1의 두 가지 유형에서 그대로 PBS를 격리하는 간단하고 표준적인 방법을 설명합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 자당의 불연속 밀도 그라데이션에 세포 균질화 및 초원심 분리입니다. 일반적으로 필라멘트 세포의 중단은 단세포 세포보다 더 복잡합니다. 시작 물질의 양을 증가 (세포 펠릿의 젖은 무게) 및 구슬 구타의 반복?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기술 공용, 생명 과학 대학, 울트라 센드 심분리기의 편리한 사용에 대한 국립 대만 대학 감사합니다. 시아노균 균주 시코시티스 sp. PCC 6803 및 렙토립비아 sp. JSC-1은 미국 펜실베이니아 주립 대학의 아카데미미아 시니카의 추, Hsiu-An 박사, 미국 펜실베이니아 주립 대학의 도널드 A. 브라이언트 박사로부터 각각 재능이 있었습니다. 이 작품은 과학기술부(대만)(109-2636-B-002-013-110-2628-B-002-065-)와 교육부(대만) 유산영장프로그램(109V1102, 110V102)이 지원했다.
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
Referências
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