Isolamento e Caracterização de Ficobilisome intacto em cianobactérias

Summary

O protocolo atual detalha o isolamento de ficobilísomees de cianobactérias por centrifugação através de um gradiente de densidade de sacarose descontínua. As frações de ficobilismos intactos são confirmadas pelo espectro de emissão fluorescente de 77K e pela análise de SDS-PAGE. As frações ficobilínicas resultantes são adequadas para coloração negativa da TEM e análise de espectrometria de massa.

Abstract

Em cianobactérias, o ficobiliso é um complexo proteico de antena vital que colhe luz e transfere energia para fotossistema I e II para fotoquímica. Estudar a estrutura e a composição do ficobilisome é de grande interesse para os cientistas porque revela a evolução e divergência da fotossíntese nas cianobactérias. Este protocolo fornece um método detalhado e otimizado para quebrar células cianobacterianas a baixo custo por um batedor de contas de forma eficiente. O ficobiliso intacto pode então ser isolado do extrato celular por ultracentrifugação gradiente de sacarose. Este método demonstrou ser adequado tanto para cianobactérias modelo quanto não modelo com diferentes tipos de células. Um procedimento passo a passo também é fornecido para confirmar a integridade e propriedade de ficobiliproteínas por espectroscopia de fluorescência de 77K e SDS-PAGE manchada por sulfato de zinco e Coomassie Blue. O ficobiliso isolado também pode ser submetido a novas análises estruturais e composicionais. No geral, este protocolo fornece um guia de partida útil que permite aos pesquisadores não familiarizados com cianobactérias isolar e caracterizar ficobilisma intacta.

Introduction

Ficobilisome (PBS) é um enorme complexo de proteína pigmento solúvel em água que se liga ao lado citoplasmático dos fotossistemas nas membranas thylakoidas de cianobactérias1. A PBS é composta principalmente de ficobiliproteínas coloridas e proteínas de linker ^incolor1,2. As ficobiliproteínas podem ser divididas em quatro grandes grupos: ficoerthrina, ficoerytrocyanina, ficocitanina e ^{alofilianina3}. Os quatro principais grupos absorvem diferentes comprimentos de onda de energia leve na faixa de 490-650 nm, que clorofilas absorviam ineficientemente3. O PBS pode servir como uma antena de captação de luz para coletar energia leve e entregá-la ao Photosystem II e ^I4.

A estrutura e a composição da PBS variam de espécie para espécie. Coletivamente, três formas de ficobiliso (hemidiscodial, em forma de feixe e em forma de vara) foram identificadas em diferentes espécies cianobacterianas5. Mesmo na mesma espécie, a composição da PBS muda em resposta ao meio ambiente, como qualidade da luz e esgotamento de nutrientes6,7,8,9,10,11. Portanto, o procedimento experimental para isolar a PBS das cianobactérias tem sido fundamental no estudo do ^PBS12. Ao longo de várias décadas, diversos protocolos isolaram a PBS e analisaram sua estrutura, composição e função6,7,8,12,13,14,15,16,17. A grande variedade de métodos para o isolamento da PBS de fato proporciona flexibilidade na isolação do complexo em diferentes espécies com diferentes reagentes e instrumentos. No entanto, também torna a escolha de um protocolo adequado mais difícil para cientistas que não estão familiarizados com cianobactérias e PBS. Portanto, um protocolo generalizado e direto é desenvolvido neste trabalho para os interessados em iniciar o isolamento da PBS a partir de cianobactérias.

Os métodos para isolar a PBS de publicações anteriores são resumidos aqui. Uma vez que o PBS é um complexo proteico solúvel em água e é prontamente dissociado, um tampão de fosfato de alta resistência iônica é necessário para estabilizar a PBS durante a ^extração18. Vários artigos de pesquisa que descrevem métodos para o isolamento da PBS de cianobacterium foram publicados no passado. A maioria dos métodos requer uma alta concentração de tampão fosfato8,14,15,18,19. No entanto, os procedimentos para interrupção mecânica das células variam, como extração assistida por contas de vidro, ^{sonicação20} e prensa francesa6,8,14. Diferentes ficobiliproteínas podem ser obtidas por precipitação com sulfato de ^amônio20 e purificadas por ^HPLC21 ou uma coluna cromatográfica22. Por outro lado, a PBS intacta pode ser facilmente isolada por ultracentrifugação gradiente de densidade de sacarose6,8,15.

Neste protocolo, um modelo de cianobacterium e um cianobacterium não modelo foram utilizados como materiais para o isolamento da PBS. São eles modelo unicelular tolerante à glicose Synechocystis sp. PCC 6803 (doravante Syn6803) e não-modelo filamentous Leptolyngbya sp. JSC-1 (doravante JSC-1), respectivamente7,23,24. O protocolo começa pela interrupção das cianobactérias unicelulares e filamentosas em um tampão fosfato de alta resistência iônica. Após a lise, os supernacantes são coletados por centrifugação e, em seguida, tratados com um detergente noniônico (Triton X-100) para solubilizar as proteínas solúveis em água das membranas thylakoid. As proteínas solúveis em água totais são aplicadas a um gradiente de densidade de sacarose descontínua para fracionar o PBS. O gradiente de sacarose descontínuo neste protocolo consiste em quatro soluções de sacarose e partições o PBS intacto nas frações mais baixas da camada de ^sacarose25. A integridade do PBS pode ser analisada por SDS-PAGE, manchas de zinco e espectroscopia de fluorescência de 77K6,7,8,26. Este método é adequado para cientistas que visam isolar o PBS intacto das cianobactérias e estudar suas propriedades espectrais, estruturais e composicionais.

Há várias vantagens deste protocolo. (1) Este método é padronizado e pode ser usado para isolar PBS intacto tanto de cianobactérias unicelulares quanto filamentosas. A maioria dos artigos descreve o método aplicado em qualquer um tipo de cianobactéria4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Este método é realizado à temperatura ambiente, uma vez que o PBS se dissocia a baixa ^{temperatura19,27}. (3) Este método descreve o uso de um batedor de contas para interromper as células; portanto, é mais barato e mais seguro do que a imprensa francesa de alta pressão e possíveis danos auditivos do sonicator em outros métodos8,13,14,20. (4) Este método isola a PBS intacta por ultra centrifugação gradiente de sacarose. Desta forma, pbs intacto com diferentes tamanhos e PBS parcialmente dissociado pode ser separado com base na concentração de sacarose.

Protocol

O Synechocystis sp. PCC 6803, o modelo de cepa tolerante à glicose, foi obtido do Dr. Chu, Hsiu-An na Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, o não-modelo filamentous, foi obtido do Dr. Donald A. Bryant na Universidade Estadual da Pensilvânia, EUA. 1. Cultura celular e colheita Inoculação Células Syn6803 ou JSC-1 usando um laço de inoculação metálica em um frasco cônico de 100 mL contendo 50 mL de B-HEPES médio…

Representative Results

As células Syn6803 e JSC-1 foram cultivadas em frascos cônicos com agitação constante em meio B-HEPES a 30 °C, sob uma luz branca led (50 fótons de μmol m-2s-1) em uma câmara de crescimento preenchida com 1% (v/v) CO2. Na fase de crescimento exponencial (OD750 = ~0,5), as células foram subculturadas em meio fresco com densidade óptica final OD750 = ~0,2. Após atingir a fase de crescimento exponencial tardio (OD750 = 0,6-0,8), as culturas foram c…

Discussion

Este protocolo descreve um método simples e padrão para isolar PBS intacto em dois tipos de cianobactérias, modelo unicelular Syn6803 e não-modelo filamentous JSC-1. As etapas críticas do protocolo são a homogeneização celular e a ultracentrifugação em um gradiente de densidade descontínua de sacarose. Geralmente, a interrupção das células filamentosas é mais complicada do que as unicelulares. O aumento da quantidade do material inicial (o peso úmido da pelota celular) e a repetição da batida de contas …

Materials

0.1 mm glass beads	BioSpec	11079101	for PBS extraction
13 mL centrifugation tube	Hitachi	13PA	ultracentrifugation
40 mL centrifugation tube	Hitachi	40PA	ultracentrifugation
Acetic acid	Merck	8.1875.2500	for Coomassie Blue staining
B-HEPES medium			A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium
Brilliant Blue R-250	Sigma	B-0149	for Coomassie Blue staining
Bromophenol blue	Wako pure chemical industries	2-291	protein loading buffer
Electronic balance	Radwag	WLC 2/A2/C/2	for the wet weight measurement of cell pellets
Fluorescence spectrophotometer	Hitachi	F-7000	Spectrophotometer
Glycerol	BioShop	Gly001.500	protein loading buffer
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR22N	for buffer exchange
Leptolyngbya sp. JSC-1			from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.
Low temperature measurement accessory	Hitachi	5J0-0112	The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra
Methanol	Merck	1.07018,2511	for Coomassie Blue staining
Microcentrifuge	Thermo Fisher	Pico 21	for PBS extraction
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	for PBS extraction
Potassium phosphate dibasic	PanReac AppliChem	121512.121	for PBS extraction
Potassium phosphate monobasic	PanReac AppliChem	141509.121	for PBS extraction
Screw cap vial	BioSpec	10832	for PBS extraction
SmartView Pro Imager	Major Science	UVCI-2300	for Znic staining signal detection
Sodium dodecyl sulfate	Zymeset	BSD101	protein loading buffer
Sucrose	Zymeset	BSU101	for PBS isolation
Synechocystis sp. PCC 6803			glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan
Tris	BioShop	TRS 011.1	protein loading buffer
Triton X-100	BioShop	TRX 506.500	for PBS extraction
Ultra 10 K membrane centrifugal filter	Millipore	UFC901024	for buffer exchange
Ultra 3 K membrane centrifugal filter	Millipore	UFC500324	for buffer exchange
Ultracentrifuge	Hitachi	CP80WX	ultracentrifugation
UV/Vis spectrophotometer	Agilent	Cary 60	Spectrophotometer
Zinc sulfate	PanReac AppliChem	131787.121	for Znic staining
β-Mercaptoethanol	BioBasic	MB0338	protein loading buffer