Siyanobakterilerde Bozulmamış Fitoidinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu
Summary
Mevcut protokol, filobobizomların siyanobakterilerden santrifüjleme ile süreksiz bir sakkaroz yoğunluk gradyanı ile izolasyonunu detaylandırıyor. Sağlam fitoidürlerin fraksiyonları 77K floresan emisyon spektrumu ve SDS-PAGE analizi ile doğrulanır. Ortaya çıkan fitobilizom fraksiyonları TEM ve kütle spektrometresi analizinin negatif boyanması için uygundur.
Abstract
Siyanobakterilerde fitobilizom, ışığı toplayan ve fotokimya için fotosistem I ve II’ye enerji aktaran hayati bir anten protein kompleksidir. Fitofilizomun yapısını ve bileşimini incelemek bilim adamları tarafından büyük ilgi çekicidir, çünkü siyanobakterilerdeki fotosentezin evrimini ve ayrışmasını ortaya koymaktadır. Bu protokol, siyanobakteri hücrelerini bir boncuk çırpıcı tarafından düşük maliyetle verimli bir şekilde kırmak için ayrıntılı ve optimize edilmiş bir yöntem sağlar. Bozulmamış fitobilizom daha sonra sakkaroz gradyan ultracentrifugation ile hücre özünden izole edilebilir. Bu yöntem farklı hücre tiplerine sahip hem model hem de model dışı siyanobakteriler için uygun olduğunu göstermiştir. Çinko sülfat ve Coomassie Blue ile boyanmış 77K floresan spektroskopisi ve SDS-PAGE ile fitobiliproteinlerin bütünlüğünü ve özelliğini doğrulamak için adım adım bir prosedür de sağlanmaktadır. İzole fitoidom ayrıca daha fazla yapısal ve bileşimsel analize tabi tutulabilir. Genel olarak, bu protokol, siyanobakterilere aşina olmayan araştırmacıların bozulmamış fitobilizomları hızlı bir şekilde izole etmelerini ve karakterize etmelerini sağlayan yararlı bir başlangıç kılavuzu sağlar.
Introduction
Fitobilizom (PBS), siyanobakterilerin timlakoid zarlarındaki fotostemlerin sitoplazmik tarafına bağlanan suda çözünür pigment-protein kompleksidir1. PBS öncelikle renkli fitobiliproteinler ve renksiz bağlayıcı proteinlerden oluşur1,2. Fitobiliproteinler dört ana gruba ayrılabilir: fitoerythrin, phycoerythrocyanin, phycocyanin ve allophycocyanin3. Dört ana grup, klorofillerin verimsiz olarak emdiği 490-650 nm aralığında farklı ışık enerjisi dalga boylarını emer3. PBS, ışık enerjisi toplamak ve Fotosistem II ve I4’e teslim etmek için ışık hasat anteni olarak hizmet edebilir.
PBS’nin yapısı ve bileşimi türlerden türlere değişir. Toplu olarak, farklı siyanobakteri türlerinde üç fitoidom şekli (hemidiscodial, demet şeklinde ve çubuk şeklinde) tanımlanmıştır5. Aynı türlerde bile, PBS’nin bileşimi, ışık kalitesi ve besin tükenmesi6,7,8,9,10,11 gibi çevreye yanıt olarak değişir. Bu nedenle, PBS’yi siyanobakterilerden izole etmek için deneysel prosedür PBS12’nin incelenmesinde etkili olmuştur. Birkaç on yıl içinde, birçok farklı protokol PBS’yi izole etti ve yapısını, bileşimini ve işlevini analiz etti6,7,8,12,13,14,15,16,17. PBS izolasyonu için çok çeşitli yöntemler, kompleksi farklı türlerde farklı reaktifler ve aletlerle izole etme esnekliği sağlar. Bununla birlikte, siyanobakteriler ve PBS’ye aşina olmayan bilim adamları için uygun bir protokol seçmeyi de zorlaştırır. Bu nedenle, pbs izolasyonu siyanobakterilerden başlamak isteyenler için bu çalışmada genelleştirilmiş ve basit bir protokol geliştirilmiştir.
PBS’yi önceki yayınlardan izole etme yöntemleri burada özetlenmiştir. PBS suda çözünen bir protein kompleksi olduğundan ve kolayca ayrıştığından, ekstraksiyon sırasında PBS’yi stabilize etmek için yüksek iyonik mukavemetli fosfat tamponu gereklidir18. Geçmişte PBS’nin siyanobakteryumdan izolasyonu için yöntemleri açıklayan çeşitli araştırma makaleleri yayınlanmıştır. Yöntemlerin çoğu yüksek konsantrasyonda fosfat tamponu gerektirir8,14,15,18,19. Bununla birlikte, hücrelerin mekanik olarak bozulmasına yönelik prosedürler, cam boncuk destekli ekstraksiyon, sonication20 ve Fransız presi6,8,14 gibi değişir. Farklı fitobiliproteinler amonyum sülfat20 ile çökeltme ile elde edilebilir ve HPLC21 veya kromatografik bir sütun22 ile saflaştırılabilir. Öte yandan, sağlam PBS sakkaroz yoğunluğu gradyan ultracentrifugation6,8,15 ile kolayca izole edilebilir.
Bu protokolde PBS izolasyonu için malzeme olarak bir model siyanobakteri ve bir model dışı siyanobakteryum kullanılmıştır. Bunlar sırasıyla model tek hücreli glikoz-hoşgörülü Synechocystis sp. PCC 6803 (bundan böyle Syn6803) ve model dışı filamentli Leptolyngbya sp. JSC-1 (bundan böyle JSC-1), sırasıyla 7,23,24’tür. Protokol, yüksek iyonik mukavemetli fosfat tamponunda tek hücreli ve filamentli siyanobakterilerin bozulmasıyla başlar. Lizozdan sonra, süpernatantlar santrifüjleme ile toplanır ve daha sonra timlakoid membranlardan suda çözünen proteinleri yatıştırmak için noyonik bir deterjan (Triton X-100) ile muamele edilir. Toplam suda çözünen proteinler, PBS’yi fraksiyone etmek için süreksiz bir sakkaroz yoğunluk gradyanine uygulanır. Bu protokoldeki süreksiz sakkaroz gradyanı dört sakkaroz çözeltisi oluşur ve bozulmamış PBS’yi sakkaroz tabakasının en düşük fraksiyonlarında bölümler25. PBS’nin bütünlüğü SDS-PAGE, çinko boyama ve 77K floresan spektroskopisi6,7,8,26 ile analiz edilebilir. Bu yöntem, bozulmamış PBS’yi siyanobakterilerden izole etmeyi ve spektral, yapısal ve bileşimsel özelliklerini incelemeyi amaçlayan bilim adamları için uygundur.
Bu protokolün birkaç avantajı vardır. (1) Bu yöntem standartlaştırılmıştır ve bozulmamış PBS’yi hem tek hücreli hem de filamentli siyanobakterilerden izole etmek için kullanılabilir. Makalelerin çoğu, bir tür siyanobakteri4,7,8,12,13,14,16,18’de uygulanan yöntemi açıklar. (2) PBS düşük sıcaklıkta ayrıştığı için bu yöntem oda sıcaklığında gerçekleştirilir19,27. (3) Bu yöntem, hücreleri bozmak için boncuk çırpıcı kullanmayı açıklar; bu nedenle, yüksek basınçlı Fransız basınından ve diğer yöntemlerde sonicator’dan olası işitme hasarından daha ucuz ve güvenlidir8,13,14,20. (4) Bu yöntem, sakkaroz gradyan ultra santrifüjleme ile bozulmamış PBS’yi izole eder. Bu şekilde, farklı boyutlarda ve kısmen ayrışmış PBS’ye sahip bozulmamış PBS, sakkaroz konsantrasyonuna göre ayrılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, iki tür siyanobakteri, tek hücreli model Syn6803 ve filamentli model dışı JSC-1’de bozulmamış PBS’yi yalıtmaya yönelik basit ve standart bir yöntemi açıklar. Protokolün kritik adımları hücre homojenizasyonu ve sakkarozun süreksiz yoğunluk gradyanı üzerinde ultrasantrifüjlemedir. Genellikle, filamentli hücrelerin bozulması tek hücreli olanlardan daha karmaşıktır. Başlangıç malzemesinin miktarının (hücre peletinin ıslak ağırlığı) artırılması ve boncuk çırpma tekrarı…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, ultracentrifuge’un rahat kullanımı için Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University’ye teşekkür ediyor. Siyanobakteri suşları Synechocystis sp. PCC 6803 ve Leptolyngbya sp. JSC-1 sırasıyla Dr. Chu, Tayvan Academia Sinica’daki Hsiu-An ve ABD Pennsylvania Eyalet Üniversitesi’nden Dr. Donald A. Bryant tarafından hediye edildi. Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (Tayvan) (109-2636-B-002-013- ve 110-2628-B-002-065-) ve Eğitim Bakanlığı (Tayvan) Yushan Genç Bilgin Programı (109V1102 ve 110V1102) tarafından finanse edildi.
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
Referências
- Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model. Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).
- Glazer, A. N. Phycobilisomes: Structure and dynamics. Annual Review of Microbiology. 36, 173-198 (1982).
- Glazer, A. N. Light harvesting by phycobilisomes. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 14 (1), 47-77 (1985).
- Liu, H., et al. Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria. Science. 342 (6162), 1104 (2013).
- Bryant, D. A., Canniffe, D. P. How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).
- Hirose, Y., et al. Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria. Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).
- Gan, F., et al. Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light. Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).
- Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light. Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).
- Ho, M. Y., et al. Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).
- Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis. Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).
- Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions. Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).
- Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp. Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).
- Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light. Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).
- Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes. Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).
- Zhang, J., et al. Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica. Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).
- Li, Y., et al. Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).
- Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach. Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).
- Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301. Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).
- Gantt, E., Lipschultz, C. A., Grabowski, J., Zimmerman, B. K. Phycobilisomes from blue-green and red algae: Isolation criteria and dissociation characteristics. Plant Physiology. 63 (4), 615-620 (1979).
- Patel, A., Mishra, S., Pawar, R., Ghosh, P. K. Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat. Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).
- Zolla, L., Bianchetti, M. High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins. Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).
- Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India. Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).
- Williams, J. G. K. . Methods in Enzymology. , 766-778 (1988).
- Brown Igor, I., et al. Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits. Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).
- Wang, L., et al. Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata. PLoS One. 9 (2), 87833 (2014).
- Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).
- Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).
- Dubbs, J. M., Bryant, D. A. Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409. Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).
- Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002. Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).
- Zhang, S., Bryant, D. A. Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212. Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).
- Huang, J. Y., et al. Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Bioquímica. 55 (15), 2214-2226 (2016).
- Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris – A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f. Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga. Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).
- Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).
- Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).
- Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna. Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).
