Xenopus laevis tadpole ryggmargstranseksjon er en relevant skademetode for å studere ryggmargsskade og regenerering ved å lage et tverrsnitt som helt kutter ryggmargen på thoraxnivå.
Ryggmargsskade (SCI) er en permanent lidelse, som påvirker sentralnervesystemet (CNS) motor og sensoriske nerver, noe som resulterer i lammelse under skadestedet. Til dags dato er det ingen funksjonell gjenopprettingsterapi for SCI, og det er mangel på klarhet angående de mange kompleksene og dynamiske hendelsene som oppstår etter SCI. Mange ikke-pattedyrorganismer kan regenerere etter alvorlig SCI, som teleostfisk, urodele amfibier og larvestadier av anuran amfibier, inkludert Xenopus laevis tadpoles. Dette er bona fide modellorganismer for å studere og forstå responsen på SCI og mekanismene som ligger til grunn for vellykkede regenerative prosesser. Denne typen forskning kan føre til identifisering av potensielle mål for SCI terapeutisk intervensjon. Denne artikkelen beskriver hvordan du utfører Xenopus laevis tadpole ryggmargstranseksjon, inkludert husdyrhold, kirurgi, postsurgery omsorg og funksjonell testevaluering. Denne skademetoden kan brukes til å belyse de forskjellige trinnene i ryggmargsregenerering ved å studere cellulære, molekylære og genetiske mekanismer, samt histologisk og funksjonell evolusjon etter SCI og under regenerering av ryggmargen.
Ryggmargsskade (SCI) er en lidelse som rammer omtrent 250.000-500.000 mennesker over hele verden hvert år1. I tillegg til denne høye utbredelsen påvirker SCI sensoriske og motoriske nerver, og genererer lammelse under skadestedet og frakobling av noen indre organer fra kontrollen av CNS. Ryggmargen, en del av CNS, kan ikke regenerere, og på grunn av kompleksiteten i lidelsen og mangelen på fullstendig forståelse av alle involverte prosesser, er det fortsatt ingen effektive terapier som tillater funksjonell gjenoppretting.
Ikke-pattedyrorganismer, som teleostfisk, urodele amfibier og larvestadier av anuran amfibier, som kan regenerere ryggmargen etter alvorlig SCI2,3,4, er gode modellorganismer for å studere prosessene som styrer en vellykket regenerativ hendelse og forstå svikt i pattedyrregenerering. Denne forståelsen er av stor interesse, da den kan gi original innsikt for å utvikle nye terapeutiske mål og mulige terapier for SCI.
Den anuriske frosken, Xenopus laevis, er en utmerket modellorganisme for å studere SCI. Den har utmerket regenerativ kapasitet i tadpole-stadier, som gradvis går tapt under metamorfose, slik at eksperimentering i regenerative og ikke-regenerative stadier3,5. Den etablerte skademetoden for å studere SCI i Xenopus laevis tadpoles består av hale amputasjon, hvor hele halen fjernes, inkludert vev som muskel, notokord og ryggmarg6. Denne tilnærmingen har vært medvirkende i forståelsen av generelle mekanismer for regenerative prosesser4,7,8,9,10.
Ettersom hale amputasjon innebærer flere vev i tillegg til ryggmargen, som er forskjellig fra hva som skjer etter menneskelig SCI, er det nødvendig med et mer relevant skadeparadigme for studiet av SCI. Vi har stolt på studier brukt i det siste11 for å generere omfattende beskrivelser av skadeparadigmer5,12,13,14 og forskjellige metoder for studiet av SCI12,13,14,15,16,17,18 . Etter ryggmargstranseksjon kan den kaudale delen av ryggmargen isoleres for RNA og proteinuttrykk og høygjennomstrømningsanalyser14,19,20,21. I tillegg tillater intracelomiske injeksjoner av legemidler og små molekyler, samt elektroporasjon av cDNA, RNA eller morpholinos, før eller etter ryggmargstranseksjon, studiet av effekten av disse molekylene i forebygging eller behandling av SCI eller av spesifikke hendelser som oppstår etter SCI og ryggmargsregenerering13,14 . Videre kan skadeutvikling og regenerative prosesser studeres på forskjellige tidspunkter etter skade ved hjelp av biokjemiske, molekylære, histologiske og funksjonelle tilnærminger12,13,14,17,19,20,21,22,23.
Til slutt kan alle de nevnte teknikkene brukes i ikke-regenerative stadier, og fremhever en av de viktigste fordelene ved å bruke Xenopus laevis som modellorganisme for å studere SCI, de komparative studiene av regenerative og ikke-regenerative mekanismer i samme art13,19,20,21,22. Dette papiret presenterer en protokoll for Xenopus laevis tadpole ryggmargstranseksjon, som starter med iscenesettelse og valg av regenerative Nieuwkoop og Faber (NF) trinn 50 tadpoles. Dette etterfølges av beskrivelsen av prosedyrene for ryggmargskirurgi for å produsere skam og transekterte dyr, postsurgisk omsorg, og til slutt analysen av funksjonell utvinning ved måling av fri tadpole svømmeavstand.
Protokollen som er beskrevet her, er en utmerket metode for å utføre SCI og evaluere funksjonell gjenoppretting. For reproduserbarhet er det viktig å dyrke sunne tadpoles og velge dyr som er like i størrelse. Mangel på riktig fôring genererer næringsstress, noe som resulterer i dårlig regenerativ kapasitet26; Derfor bør det tas særlig hensyn til tadpole fôring. Når tadpoles når trinn 50 etter 3-4 uker, kan de oppdrettes ved høyere temperaturer for å akselerere vekstprosessen, 18-25 °C er optimal27. Vannkvalitet er viktig, da dyr er følsomme for vannforhold og kjemiske produkter. De optimale vannforholdene inkluderer bruk av karbonfiltrert, klorfritt vann med følgende parametere: pH (6,5-7,5), klorid (<0,02 mg/l), ledningsevne av vann (1,0 mS/cm ± 0,1 enheter), kobber (<0,3 mg/l); karbonathardhet (KH: 5-10 dKH); generell hardhet (GH: 6-16 dGH); nitrat (NO3: <20 mg/l); og nitritt (NO2: <0,1 mg/l)14,27,28. I tillegg, for å unngå forurensning, bør plasttanker rengjøres en gang i uken for oppdrett av dyr eller annenhver dag etter operasjonen ved å vaske grundig med kloridfritt vann og en svamp; rengjøringsmiddel må unngås.
For en bedre overlevelsesrate etter operasjonen må tadpoles ikke utsettes for anestesi i lange perioder (ikke lenger enn 2 min). Videre anbefales det å bedøve en tadpole om gangen. Ettersom dyrene trenger å holde seg hydrert, hold dyrene nedsenket i løsning hele tiden før og etter operasjonen, og hell løsningen med en skje på toppen av tadpole før du begynner operasjonen. Forsikre deg om at skaden er omfattende nok til å dekke hele ryggmargen, men ikke for omfattende, da den kan indusere dårlig funksjonell utvinning eller død. Hvis notokordet er skadet, vil dyret bli bøyd, og den funksjonelle utvinningen vil bli påvirket. Hvis skaden strekker seg utover notokordet, øker sannsynligheten for død14. Under svømmeanalysen anses opptak som riktig hvis programvaren identifiserer hvert dyr med en blå skygge; Ellers bør opptaket gjentas. Det er viktig å unngå bevegelses- og luft- eller lysendringer under opptaksprosessen for å forhindre opptaksfeil.
Det er fortsatt mange åpne spørsmål om de cellulære og molekylære mekanismene som ligger til grunn for ryggmargsskader og regenerering. Protokollen beskrevet i dette arbeidet kan brukes til å studere bidraget fra ulike cellulære hendelser, genuttrykk og behandlinger på funksjonell utvinning, bestemt ved å måle svømmekapasitet. I tillegg kan mange andre teknikker brukes på de opererte dyrene. Ryggmargen kan isoleres for å utføre protein- og/eller mRNA-ekstraksjon14 for å studere protein- og genuttrykksprofiler etter skade og behandling19,20. Denne operasjonen har også vært grunnlaget for å studere ryggmargen cellulær respons22 og oppførselen til nevrale stamceller 12,13,22 etter ryggmargsskade. Signalerende kaskader involvert i ryggmargsregenerering har også blitt studert ved hjelp av ryggmargsskadeparadigmet beskrevet heri23. Oppsummert er protokollen beskrevet her en utmerket modell for å studere ryggmargsskade og regenerering og har blitt brukt til mange studier som har bidratt til eksisterende kunnskap om emnet.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av forskningsstipend fra: PG Slater: FONDECYT N° 3190820; J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).
Air pump | Regent CALM | RC-006 | For oxygen diffuser stones function |
ANY-maze software | Stoelting | Swimming behavior test | |
Ca(NO3)2·4H2O | Sigma-Aldrich | 237124 | |
CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Camera | Stoelting | 60528 | Swimming behavior test |
Computer | Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 1 available USB port, 1,366 × 768 monitor) |
||
Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | Surgery / staging |
Glass Petri dishes | 100 x 20 mm | ||
HEPES | Gibco | 11344-041 | |
Human chorionic gonadotropin | It can be found in different formats in the pharmacy | ||
KCl | Merck Millipore | 104936 | |
LED light box | custom made | wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet) | |
MgSO4·7H2O | Merck Millipore | 105886 | |
Microdissection scissors for transection | Fine Science Tools | 15003-08 | Spring Scissors for surgery |
MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; tricaine mesylate |
NaCl | Merck Millipore | 106404 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus | Nasco | SB09480(LM)MX | Food for Xenopus tadpoles stage 44 to 60 |
Oxygen diffuser stones | Pentair | AA1 | Mantainance of animals |
Pair of forceps | Fine Science Tools | Dumont n° 5 SF forceps | For surgery |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P7794 | |
pH meter | |||
Plastic Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | For collecting embryos after mating |
Plastic Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5981 | 150 x 15 mm |
Plastic tank/box with lid | 4.5 liter capacity; 20 cm × 17 cm × 15 cm or similar | ||
Sterilized gauze | |||
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S1277 | |
Tablespoon | |||
Xenopus laevis specialized strains and lines |
National Xenopus Resource European Xenopus Resource Centre Xenopus laevis Research Resource Centre |
http://www.mbl.edu/xenopus https://xenopusresource.org/ https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx |
|
Xenopus laevis wild type | Xenopus 1 Xenopus Express |
https://xenopus1.com http://www.xenopus.com |