الزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد للسرطان الغدي المريئي العضوي: إيجابيات وسلبيات لهضم الخلية الواحدة
Summary
يصف هذا البروتوكول طرق الزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد للمركبات العضوية المسببة لسرطان المريء الغدي مع أو بدون هضم خلية واحدة لتمكين الباحثين من اختيار الاستراتيجيات المناسبة بناء على تصميمهم التجريبي.
Abstract
يعد عدم وجود نماذج بحثية انتقالية مناسبة تعكس المرض الأولي لاستكشاف تكوين الأورام والاستراتيجيات العلاجية عقبة رئيسية في السرطان الغدي المريئي (EAC). ظهرت المواد العضوية المشتقة من المرضى (PDOs) مؤخرا كنموذج رائع قبل السريري في مجموعة متنوعة من أنواع السرطان. ومع ذلك، لا تزال هناك بروتوكولات محدودة متاحة لتطوير منظمات تنمية نفط أفريقيا التابعة لمجموعة شرق أفريقيا. وبمجرد إنشاء مؤسسات تنمية نفط عمان، يصبح الانتشار والحفظ بالتبريد ضروريين لإجراء المزيد من التحليلات النهائية. هنا ، تم توحيد طريقتين مختلفتين للزراعة الفرعية وحفظ التبريد في EAC PDO ، أي مع وبدون هضم خلية واحدة. يمكن لكلتا الطريقتين الحصول على صلاحية مناسبة للخلية بشكل موثوق وقابلة للتطبيق على إعداد تجريبي متنوع. أظهرت الدراسة الحالية أن زراعة الباطن EAC PDOs مع هضم خلية واحدة مناسبة لمعظم التجارب التي تتطلب التحكم في عدد الخلايا ، والكثافة الموحدة ، وبنية جوفاء تسهل تتبع الحجم. ومع ذلك ، فإن الطريقة القائمة على خلية واحدة تظهر نموا أبطأ في الثقافة وكذلك بعد إعادة الزراعة من المخزونات المجمدة. إلى جانب ذلك ، يتميز التزريع الفرعي بهضم خلية واحدة بتشكيل هياكل مجوفة ذات نواة جوفاء. في المقابل ، فإن معالجة EAC PDOs دون هضم خلية واحدة مواتية للحفظ بالتبريد والتوسع والتوصيف النسيجي. في هذا البروتوكول ، يتم وصف مزايا وعيوب الزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد ل EAC PDOs مع وبدون هضم خلية واحدة لتمكين الباحثين من اختيار طريقة مناسبة لمعالجة والتحقيق في المواد العضوية الخاصة بهم.
Introduction
سرطان المريء (EC) هو العاشر الأكثر شيوعا والسبب الرئيسي السادس للوفاة من السرطان في جميع أنحاء العالم1. السرطان الغدي المريئي (EAC) هو أحد الأنواع الفرعية النسيجية الرئيسية لل EC ويحدث بشكل رئيسي في البلدان الغربية2. في العقد الأخير ، زاد معدل الإصابة ب EAC بشكل كبير في العديد من البلدان المتقدمة ، بما في ذلك ألمانيا3. بسبب عدوانية السرطان وعدم وجود أعراض خلال المرحلة المبكرة من تطور الورم ، فإن التشخيص العام في مرضى EAC ضعيف ، حيث يظهر معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات حوالي 20٪ 2,4,5.
منذ أواخر القرن العشرين ، تم إنشاء العديد من النماذج للبحوث الطبية الحيوية في EAC. خطوط خلايا EAC البشرية الكلاسيكية التي تم إنشاؤها في 1990s6 ، توسع معرفتنا ببيولوجيا أورام EAC ، وعلم الوراثة للورم ، بالإضافة إلى استراتيجيات مكافحة الورم ، وتستخدم عادة في أبحاث EAC. إلى جانب ذلك ، نجحت بعض المجموعات البحثية في تطوير نماذج حيوانية من EAC أو مريء باريت عن طريق تعريض الحيوانات لعوامل الخطر المعروفة مثل الارتجاع المعدي المريئي من خلال الأساليب الجراحية أو الالتهابية 7,8,9. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير نماذج xenograft (PDX) المشتقة من المريض والتي تغرس أنسجة السرطان الأولية EAC تحت الجلد أو بشكل تقويمي في الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، لمحاكاة السلوك البيولوجي البشري لورم EAC وبيئة الورم 10،11،12. ومع ذلك ، على الرغم من أن هذه النماذج تعمل على تحسين التطبيقات السريرية وفهمنا للآليات الجزيئية وراء تكوين الأورام وتطورها في EAC ، لا يزال هناك تحد كبير لاستقراء النتائج من هذه النماذج البحثية للبشر.
تزرع المواد العضوية المشتقة من المريض (PDOs) في نظام ثقافة 3D الذي يحاكي التنمية البشرية وتجديد الأعضاء في المختبر. تقوم PDOs المتولدة من الأنسجة الأولية للمرضى بتلخيص الخصائص الجزيئية والمظهرية للورم البشري وأظهرت تطبيقات واعدة في تطوير الأدوية وعلاج السرطان الشخصي13,14. ومن خلال مقارنة عشر حالات من منظمات تنمية نفط أفريقيا مع أنسجة الورم المقترنة بها، تفيد التقارير بأن هذه الحالات تشترك في سمات نسيجية مرضية مماثلة ومشهد جينومي مع الورم الأساسي، وتحتفظ بعدم التجانس داخل الورم وتسهل الفحص الفعال للأدوية في المختبر15. كما تم استخدام منظمات تنمية نفط أفريقيا في دراسة تفاعل الخلايا السرطانية التابعة ل EAC مع الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) المشتقة من المريض ، مما يشير إلى وجود تطبيق قوي في مجال أبحاث البيئة الدقيقة للورم16. لسوء الحظ ، كانت هناك بروتوكولات محدودة متاحة لتطوير ونشر منظمات تنمية نفط EAC. هنا ، يتم وصف طريقتين مختلفتين للزراعة الفرعية والحفاظ على PDOs EAC بالتفصيل: مع وبدون هضم خلية واحدة. يمكن للطرق الموحدة لصيانة منظمات تنمية نفط أفريقيا وتطبيقاتها أن تدعم الباحثين لاختيار الأساليب المناسبة لأغراض مختلفة في أبحاثهم الخاصة بشركة تنمية نفط أفريقيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول ، يتم وصف طريقتين مختلفتين للزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد ل EAC PDOs ، أي مع وبدون هضم خلية واحدة. أوصت العديد من الدراسات بتمرير PDOs EAC مع هضم خلية واحدة15,17 ، وهو أمر مفيد لمعظم التجارب التي تتطلب التحكم في عدد الخلايا ، وكثافة موحدة ، وبنية مج?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل برنامج كولن فورتشن / كلية الطب ، جامعة كولونيا. ونشكر المساعدة التقنية المقدمة من سوزان نيس وميكايلا هايتمان وأنكي ويناند – دورفيلر. تم دعم Ningbo Fan ماليا من قبل مجلس قوانغتشو للمنح الدراسية للنخبة (GESC). يشكر المؤلفون الدكتور جوشوا دي روزاريو على مساعدته في التحرير اللغوي.
Materials
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
Referências
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Coleman, H. G., Xie, S. -. H., Lagergren, J. The epidemiology of esophageal adenocarcinoma. Gastroenterology. 154 (2), 390-405 (2018).
- Rumgay, H., et al. International trends in esophageal squamous cell carcinoma and adenocarcinoma incidence. The American Journal of Gastroenterology. 116 (5), 1072-1076 (2021).
- Qian, H., et al. Clinical characteristics, prognosis, and nomogram for esophageal cancer based on adenosquamous carcinoma: a seer database analysis. Frontiers in Oncology. 11, 603349 (2021).
- Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. Oesophageal cancer. Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).
- Rockett, J. C., Larkin, K., Darnton, S. J., Morris, A. G., Matthews, H. R. Five newly established oesophageal carcinoma cell lines: phenotypic and immunological characterization. British Journal of Cancer. 75 (2), 258-263 (1997).
- Hashimoto, N. Expression of COX2 and p53 in rat esophageal cancer induced by reflux of duodenal contents. ISRN Gastroenterology. 2012, 1-5 (2012).
- Quante, M., et al. Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of barrett-like metaplasia. Cancer Cell. 21 (1), 36-51 (2012).
- Kapoor, H., Lohani, K. R., Lee, T. H., Agrawal, D. K., Mittal, S. K. Animal models of Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma-past, present, and future. Clinical and Translational Science. 8 (6), 841-847 (2015).
- Lan, T., Xue, X., Dunmall, L. C., Miao, J., Wang, Y. Patient-derived xenograft: a developing tool for screening biomarkers and potential therapeutic targets for human esophageal cancers. Aging. 13 (8), 12273-12293 (2021).
- Liu, D. S. H., et al. APR-246 potently inhibits tumour growth and overcomes chemoresistance in preclinical models of oesophageal adenocarcinoma. Gut. 64 (10), 1506-1516 (2015).
- Ebbing, E. A., et al. Esophageal adenocarcinoma cells and xenograft tumors exposed to Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 and 3 inhibitors activate transforming growth factor beta signaling, which induces epithelial to mesenchymal transition. Gastroenterology. 153 (1), 63-76 (2017).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Li, X., et al. Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics. Nature Communications. 9, 2983 (2018).
- Ebbing, E. A., et al. Stromal-derived interleukin 6 drives epithelial-to-mesenchymal transition and therapy resistance in esophageal adenocarcinoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2237-2242 (2019).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Ordóñez, N. G. Broad-spectrum immunohistochemical epithelial markers: a review. Human Pathology. 44 (7), 1195-1215 (2013).
- Maniar, K. P., Umpires, B. Cytokeratin 7 (CK7, K7). Pathology Outlines.com website. , (2021).
- Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
