Subcultuur en cryopreservatie van oesofageaal adenocarcinoom organoïden: voor- en nadelen voor eencellige spijsvertering

Summary

Dit protocol beschrijft de methoden van subcultuur en cryopreservatie van oesofageale adenocarcinoom organoïden met en zonder eencellige vertering om onderzoekers in staat te stellen geschikte strategieën te kiezen op basis van hun experimentele ontwerp.

Abstract

Het gebrek aan geschikte translationele onderzoeksmodellen die primaire ziekte weerspiegelen om tumorigenese en therapeutische strategieën te onderzoeken, is een groot obstakel bij oesofageaal adenocarcinoom (EAC). Patient-derived organoids (PDOs) zijn onlangs naar voren gekomen als een opmerkelijk preklinisch model in een verscheidenheid aan kankers. Er zijn echter nog steeds beperkte protocollen beschikbaar voor het ontwikkelen van OAG-BOB’s. Zodra de BOB’s zijn vastgesteld, zijn de vermeerdering en cryopreservatie essentieel voor verdere downstream-analyses. Hier zijn twee verschillende methoden gestandaardiseerd voor EAC PDOs subcultuur en cryopreservatie, d.w.z. met en zonder eencellige vertering. Beide methoden kunnen op betrouwbare wijze de juiste levensvatbaarheid van de cel verkrijgen en zijn toepasbaar voor een diverse experimentele opstelling. De huidige studie toonde aan dat het subcultureren van EAC-BOB’s met eencellige spijsvertering geschikt is voor de meeste experimenten die celnummercontrole, uniforme dichtheid en een holle structuur vereisen die het volgen van de grootte vergemakkelijkt. De op één cel gebaseerde methode laat echter een langzamere groei zien in de teelt en na herkweek uit bevroren bestanden. Bovendien wordt subculturing met eencellige spijsvertering gekenmerkt door het vormen van holle structuren met een holle kern. Daarentegen is het verwerken van EAC-BOB’s zonder eencellige vertering gunstig voor cryopreservatie, expansie en histologische karakterisering. In dit protocol worden de voor- en nadelen beschreven van subculturen en cryopreservatie van EAC BOB’s met en zonder eencellige vertering om onderzoekers in staat te stellen een geschikte methode te kiezen om hun organoïden te verwerken en te onderzoeken.

Introduction

Slokdarmkanker (EC) is de tiende meest voorkomende en de zesde belangrijkste doodsoorzaak van kanker wereldwijd¹. Oesofageaal adenocarcinoom (EAC) is een van de belangrijkste histologische subtypen van EC en komt voornamelijk voor in westerse landen². In het afgelopen decennium is de EAC-incidentie aanzienlijk toegenomen in veel ontwikkelde landen, waaronder Duitsland³. Vanwege de agressiviteit van kanker en het ontbreken van symptomen tijdens het vroege stadium van tumorontwikkeling, is de algemene prognose bij EAC-patiënten slecht, met een 5-jaarsoverleving van ongeveer 20% ^2,4,5.

Sinds het einde van de twintigste eeuw zijn er verschillende modellen opgesteld voor het biomedisch onderzoek van EAC. De klassieke menselijke EAC-cellijnen die werden opgericht in de jaren 1990⁶, breiden onze kennis van EAC-tumorbiologie, tumorgenetica en antitumorstrategieën uit en worden vaak gebruikt in EAC-onderzoek. Bovendien hebben sommige onderzoeksgroepen met succes diermodellen van EAC of Barrett’s slokdarm ontwikkeld door de dieren bloot te stellen aan bekende risicofactoren zoals gastro-oesofageale reflux door chirurgische of inflammatoire benaderingen ^7,8,9. Daarnaast werden patiënt-afgeleide xenograft (PDX) modellen die EAC primaire kankerweefsels subcutaan of orthotopisch enten in immunodeficiënte muizen, ontwikkeld om menselijk EAC tumor biologisch gedrag en tumoromgeving te simuleren 10,11,12. Ondanks dat deze modellen klinische toepassingen verbeteren en ons begrip van moleculaire mechanismen achter EAC-tumorigenese en progressie, is er nog steeds een grote uitdaging om de resultaten van deze onderzoeksmodellen naar mensen te extrapoleren.

Patiënt-afgeleide tumor organoïden (BOB’s) worden gekweekt in een 3D-kweeksysteem dat de menselijke ontwikkeling en orgaanregeneratie in vitro nabootst. Gegenereerd uit het primaire weefsel van patiënten, reconstrueren PDO’s de moleculaire en fenotypische kenmerken van de menselijke tumor en hebben veelbelovende toepassingen aangetoond bij de ontwikkeling van geneesmiddelen en gepersonaliseerde kankerbehandeling^13,14. Door tien gevallen van EAC-BOB’s te vergelijken met hun gepaarde tumorweefsel, wordt gemeld dat EAC-BOB’s vergelijkbare histopathologische kenmerken en genomisch landschap delen met de primaire tumor, intratumorering heterogeniteit behouden en efficiënte screening van geneesmiddelen in vitro¹⁵ vergemakkelijken. EAC PDO’s werden ook gebruikt bij het bestuderen van de interactie van EAC-tumorcellen met patiënt-afgeleide kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs), wat wijst op een krachtige toepassing op het gebied van tumormicro-omgevingsonderzoek¹⁶. Helaas zijn er beperkte protocollen beschikbaar voor het ontwikkelen en verspreiden van EAC-BOB’s. Hier worden twee verschillende methoden beschreven voor het subcultureren en conserveren van EAC-BOB’s in detail: met en zonder eencellige vertering. De gestandaardiseerde methoden voor het onderhoud van EAC BOB’s en hun toepassingen kunnen onderzoekers ondersteunen bij het kiezen van geschikte methoden voor verschillende doeleinden in hun EAC BOB-onderzoek.

Protocol

Een gevestigde en goed groeiende BOB-cultuur vormt de basis voor een succesvolle subcultuur en cryopreservatie zoals beschreven in dit protocol. Hier werden EAC BOB’s gegenereerd uit het primaire tumorweefsel van EAC-patiënten met behulp van het protocol beschreven door Karakasheva T. A. et al17. EAC-weefsels werden verzameld uit de biobank onder de goedkeuring van BioMaSOTA (goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Keulen, ID: 13-091). OPMERKING:…

Representative Results

Dit protocol presenteert de procedures inclusief subcultuur en cryopreservatie van EAC BOB’s met en zonder eencellige vertering. Figuur 1 toont representatieve fasecontrastfoto’s van de twee verschillende subcultuurstrategieën. EAC-BOB’s bereikten de juiste dichtheid voor subculturing (figuur 1, links). Subculturen zonder eencellige vertering kost minder tijd om een vergelijkbare dichtheid te bereiken en leidt vooral tot compacte str…

Discussion

In dit protocol worden twee verschillende subcultuur- en cryopreservatiemethoden van EAC-BOB’s beschreven, namelijk met en zonder eencellige vertering. Verschillende studies adviseerden het doorgeven van EAC-BOB’s met eencellige vertering^15,17, wat gunstig is voor de meeste experimenten die celnummercontrole, uniforme dichtheid en een holle structuur vereisen die het volgen van de grootte vergemakkelijkt. De op één cel gebaseerde methode wordt echter gekenmerkt…

Materials

Equipment
-20°C Freezer	Bosch		Economic
-80°C Freezer	Panasonic		MDF DU500VH-PE
Automated Cell counter	Thermo Fisher	AMQAX1000	Countess II
Biological Safety Cabinet Class II	Thermo Scientific	51022482	Herasafe KS12
Centrifuge	Heraeus	75003060	Megafuge 1.0R
CO2 Incubator	Thermo Scientific	50116048	Heracell 150i
Inverted automated fluorescence microscope	Olympus		IX83
Inverted light microscope	Leica		DMIL LED Fluo
Pipette 1000 µL	Eppendorf	3123000063	Research Plus
Pipette 200 µL	Eppendorf	3123000039	Research Plus
Rotating Incubator	Scientific Industries, sc.	SI-1200	Enviro-genie
Shaker	Eppendorf	5355 000.011	Thermomixer Comfort
Vacuum pump	Vacuubrand	20727200	BVC control
Waterbath	Medingen	p2725	W22
Material
15 mL tube	Sarstedt	62.554.502	Inc Screw cap tube PP 15 mL
Cryo vial 2 mL	Sarstedt	72.379	CryoPure 2.0 mL tube
Low bind tube 1.5 mL	Sarstedt	72.706.600	Micro tube 1.5 mL protein LB
Low bind tube 5 mL	Eppendorf	0030 108.302	Protein LoBind Tube 5.0 mL
Pipette tip 200 µL	Starlab	E1011-8000	200 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL	Starlab	E1011-9000	1000 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL	Sarstedt	70.3050	Pipette tip 1000 µL
Sterile filter 0.2 µm	Sarstedt	83.1826.001	Filtropur 0.2 µm sterile filter
Tissue culture plate	Sarstedt	83.3921	12 well-plate
Reagent/Chemical
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
B-27	Thermo Fisher Scientific	17504001
Cell Recovery Solution	Corning	354253
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182/CS-0181
DNase I grade II, from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	10104159001
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190094
Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	356231
FGF-10a	Peprotech	100-26-100
Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium	Thermo Fisher Scientific	12648010
Gastrin	Sigma	G9020
Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL)	PromoCell	C-36030
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080
L-Glutamine 200 mM (100X)	Thermo Fisher Scientific	25030024
N-2	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165
Nicotinamide	Sigma	N0636-100
Noggin	Peprotech	120-10C-50
Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells	Biotechne	3710-001-01
SB202190	MedChemExpress	152121-30-7
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma-Aldrich	93620-1G
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Wnt-3A conditioned medium	Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group
Y-27632	Sigma	Y0503