Subkultur og kryopreservering av Esophageal Adenocarcinoma Organoider: Fordeler og ulemper for fordøyelsen med én celle

Summary

Denne protokollen beskriver metodene for subkultur og kryopreservering av esophageal adenokarcinoma organoider med og uten enkeltcellet fordøyelse for å gjøre det mulig for forskere å velge passende strategier basert på deres eksperimentelle design.

Abstract

Mangelen på egnede translasjonelle forskningsmodeller som reflekterer primærsykdom for å utforske tumorigenese og terapeutiske strategier er et stort hinder i esophageal adenokarsinom (EAC). Pasientavledede organoider (PUD) har nylig dukket opp som en bemerkelsesverdig preklinisk modell i en rekke kreftformer. Det er imidlertid fortsatt begrensede protokoller tilgjengelig for utvikling av EAC-PDA-er. Når PUD-ene er etablert, er forplantning og kryopreservering avgjørende for ytterligere nedstrømsanalyser. Her har to forskjellige metoder blitt standardisert for EAC PDOer subkultur og kryopreservering, det vil si med og uten enkeltcelle fordøyelse. Begge metodene kan på en pålitelig måte oppnå passende celle levedyktighet og gjelder for et mangfoldig eksperimentelt oppsett. Den nåværende studien viste at subkulturerende EAC-PUD-er med enkeltcellet fordøyelse er egnet for de fleste eksperimenter som krever cellenummerkontroll, jevn tetthet og en hul struktur som letter størrelsessporing. Den encellede metoden viser imidlertid lavere vekst i kulturen så vel som etter re-dyrking fra frosne aksjer. Dessuten er subkulturering med encellet fordøyelse preget av å danne hule strukturer med en hul kjerne. I motsetning er behandling av EAC-PUD-er uten enkeltcelle fordøyelse gunstig for kryopreservering, ekspansjon og histologisk karakterisering. I denne protokollen beskrives fordelene og ulempene ved subkulturering og kryopreservering av EAC-PUD-er med og uten enkeltcellet fordøyelse for å gjøre det mulig for forskere å velge en passende metode for å behandle og undersøke organoidene sine.

Introduction

Esophageal cancer (EC) er den tiende vanligste og den sjette ledende dødsårsaken fra kreft over hele verden¹. Esophageal adenocarcinoma (EAC) er en av de viktigste histologiske undertypene av EC og forekommer hovedsakelig i vestlige land². I løpet av det siste tiåret har EAC-forekomsten økt betydelig i mange utviklede land, inkludert Tyskland³. På grunn av aggressiviteten til kreft og mangel på symptomer i den tidlige fasen av tumorutviklingen, er den generelle prognosen hos EAC-pasienter dårlig, og viser en 5-års overlevelsesrate på ca. 20%^2,4,5.

Siden slutten av det tjuende århundre har det blitt etablert flere modeller for biomedisinsk forskning av EAC. De klassiske menneskelige EAC-cellelinjene som ble etablert på 1990-tallet⁶, utvider vår kunnskap om EAC tumorbiologi, tumorgenetikk samt anti-tumorstrategier, og brukes ofte i EAC-forskning. Dessuten har noen forskningsgrupper vellykket utviklet dyremodeller av EAC eller Barretts spiserøret ved å utsette dyrene for kjente risikofaktorer som gastroøsofageal refluks gjennom kirurgiske eller inflammatoriske tilnærminger ^7,8,9. I tillegg ble pasientavledede xenograft (PDX) modeller som engraft EAC primærkreftvev subkutant eller ortopisk til immunodeficient mus, utviklet for å simulere menneskelig EAC tumor biologisk oppførsel og tumormiljø 10,11,12. Til tross for at disse modellene forbedrer kliniske anvendelser og vår forståelse av molekylære mekanismer bak EAC tumorigenesis og progresjon, er det imidlertid fortsatt en stor utfordring å ekstrapolere resultater fra disse forskningsmodellene til mennesker.

Pasientavledede tumororganoider (PUD) dyrkes i et 3D-kultursystem som etterligner menneskelig utvikling og organregenerering in vitro. Pdoer er generert fra pasientenes primærvev, og rekapitulerer de molekylære og fenotypiske egenskapene til den menneskelige svulsten og har vist lovende anvendelser innen legemiddelutvikling og personlig kreftbehandling^13,14. Ved å sammenligne ti tilfeller av EAC-PUD-er med deres parrede tumorvev, rapporteres EAC-PUD-er å dele lignende histopatologiske egenskaper og genomisk landskap med den primære svulsten, beholde intrasvulst heterogenitet og legge til rette for effektiv legemiddelscreening in vitro¹⁵. EAC-PUD-er ble også brukt til å studere samspillet mellom EAC-tumorceller og pasientavledede kreftrelaterte fibroblaster (CAF-er), noe som indikerer en kraftig anvendelse innen tumormikromiljøforskning¹⁶. Dessverre har det vært begrensede protokoller tilgjengelig for utvikling og forplantning av EAC-P PUD-er. Her er to forskjellige metoder beskrevet for subkulturering og bevaring av EAC-PUD i detalj: med og uten enkeltcelle fordøyelse. Standardiserte metoder for vedlikehold av EAC-PUD-er og deres anvendelser kan støtte forskere til å velge passende metoder for ulike formål i sin EAC PUD-forskning.

Protocol

En etablert og velvoksende PUD-kultur representerer grunnlaget for en vellykket subkultur og kryopreservering beskrevet i denne protokollen. Her ble EAC-PUD generert fra EAC-pasienters primære tumorvev ved hjelp av protokollen beskrevet av Karakasheva T. A. et al17. EAC vev ble samlet inn fra biobank under godkjenning av BioMaSOTA (godkjent av Etikkkomiteen ved Universitetet i Köln, ID: 13-091). MERK: EAC-PUD-er har blitt dyrket i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 %…

Representative Results

Denne protokollen presenterer prosedyrene inkludert subkultur og kryopreservering av EAC-PUD-er med og uten fordøyelse av enkeltceller. Figur 1 viser representative fasekontrastbilder av de to ulike subkulturstrategiene. EAC-PDI-er nådde riktig tetthet for subkulturering (figur 1, venstre). Subkulturering uten enkeltcellet fordøyelse tar mindre tid å nå sammenlignbar tetthet og fører hovedsakelig til kompakte strukturer (<strong…

Discussion

I denne protokollen beskrives to forskjellige subkultur- og kryopreserveringsmetoder for EAC-PUD-er, det vil si med og uten fordøyelse av enkeltceller. Flere studier anbefalte å passere EAC-PUD-er med encellet fordøyelse^15,17, noe som er gunstig for de fleste eksperimenter som krever cellenummerkontroll, jevn tetthet og en hul struktur som letter størrelsessporing. Imidlertid er den encellebaserte metoden preget av langsommere vekst etter fordring fra frosne …

Materials

Equipment
-20°C Freezer	Bosch		Economic
-80°C Freezer	Panasonic		MDF DU500VH-PE
Automated Cell counter	Thermo Fisher	AMQAX1000	Countess II
Biological Safety Cabinet Class II	Thermo Scientific	51022482	Herasafe KS12
Centrifuge	Heraeus	75003060	Megafuge 1.0R
CO2 Incubator	Thermo Scientific	50116048	Heracell 150i
Inverted automated fluorescence microscope	Olympus		IX83
Inverted light microscope	Leica		DMIL LED Fluo
Pipette 1000 µL	Eppendorf	3123000063	Research Plus
Pipette 200 µL	Eppendorf	3123000039	Research Plus
Rotating Incubator	Scientific Industries, sc.	SI-1200	Enviro-genie
Shaker	Eppendorf	5355 000.011	Thermomixer Comfort
Vacuum pump	Vacuubrand	20727200	BVC control
Waterbath	Medingen	p2725	W22
Material
15 mL tube	Sarstedt	62.554.502	Inc Screw cap tube PP 15 mL
Cryo vial 2 mL	Sarstedt	72.379	CryoPure 2.0 mL tube
Low bind tube 1.5 mL	Sarstedt	72.706.600	Micro tube 1.5 mL protein LB
Low bind tube 5 mL	Eppendorf	0030 108.302	Protein LoBind Tube 5.0 mL
Pipette tip 200 µL	Starlab	E1011-8000	200 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL	Starlab	E1011-9000	1000 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL	Sarstedt	70.3050	Pipette tip 1000 µL
Sterile filter 0.2 µm	Sarstedt	83.1826.001	Filtropur 0.2 µm sterile filter
Tissue culture plate	Sarstedt	83.3921	12 well-plate
Reagent/Chemical
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
B-27	Thermo Fisher Scientific	17504001
Cell Recovery Solution	Corning	354253
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182/CS-0181
DNase I grade II, from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	10104159001
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190094
Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	356231
FGF-10a	Peprotech	100-26-100
Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium	Thermo Fisher Scientific	12648010
Gastrin	Sigma	G9020
Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL)	PromoCell	C-36030
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080
L-Glutamine 200 mM (100X)	Thermo Fisher Scientific	25030024
N-2	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165
Nicotinamide	Sigma	N0636-100
Noggin	Peprotech	120-10C-50
Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells	Biotechne	3710-001-01
SB202190	MedChemExpress	152121-30-7
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma-Aldrich	93620-1G
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Wnt-3A conditioned medium	Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group
Y-27632	Sigma	Y0503