Subkultur och kryokonservering av esofagusadenokarcinomorganoider: Fördelar och nackdelar för encellsförtunning

Summary

Detta protokoll beskriver metoderna för subkultur och kryokonservering av esofageal adenokarcinomorganoider med och utan encellsförtunning för att göra det möjligt för forskare att välja lämpliga strategier baserat på deras experimentella design.

Abstract

Bristen på lämpliga translationella forskningsmodeller som återspeglar primär sjukdom för att utforska tumorigenes och terapeutiska strategier är ett stort hinder i matstrupen adenokarcinom (EAC). Patient-härledda organoider (PDO) har nyligen framträtt som en anmärkningsvärd preklinisk modell i en mängd olika cancerformer. Det finns dock fortfarande begränsade protokoll tillgängliga för att utveckla EAC PDOs. När underofficerarna har fastställts är förökning och kryokonservering avgörande för ytterligare analyser nedströms. Här har två olika metoder standardiserats för EAC PDOs subkultur och kryokonservering, dvs med och utan encellsförtunning. Båda metoderna kan på ett tillförlitligt sätt erhålla lämplig cellviabilitet och är tillämpliga för en mångsidig experimentell inställning. Den aktuella studien visade att subkulturerande EAC-SUB med encellsförtunning är lämplig för de flesta experiment som kräver cellnummerkontroll, enhetlig densitet och en ihålig struktur som underlättar storleksspårning. Den enda cellbaserade metoden visar dock långsammare tillväxt i odling såväl som efter återodling från frysta lager. Dessutom kännetecknas subkulturering med encellsförtunning genom att bilda ihåliga strukturer med en ihålig kärna. Däremot är bearbetning av EAC-SUB utan encellsförtunning gynnsam för kryokonservering, expansion och histologisk karakterisering. I detta protokoll beskrivs fördelarna och nackdelarna med subkulturering och kryokonservering av EAC-SUB med och utan encellsförtunning för att göra det möjligt för forskare att välja en lämplig metod för att bearbeta och undersöka sina organoider.

Introduction

Matstrupscancer (EC) är den tionde vanligaste och den sjätte vanligaste dödsorsaken i cancer världen över¹. Esofagusadenokarcinom (EAC) är en av de viktigaste histologiska subtyperna av EC och förekommer främst i västländer². Under det senaste decenniet har EAC-förekomsten ökat avsevärt i många utvecklade länder, inklusive Tyskland³. På grund av cancerns aggressivitet och bristen på symtom under det tidiga skedet av tumörutveckling är den totala prognosen hos EAC-patienter dålig, vilket visar en 5-årig överlevnad på cirka 20%^2,4,5.

Sedan slutet av 1900-talet har flera modeller etablerats för EAC: s biomedicinska forskning. De klassiska humana EAC-cellinjerna som etablerades på 1990-talet⁶, utökar vår kunskap om EAC-tumörbiologi, tumörgenetik samt antitumörstrategier och används ofta i EAC-forskning. Dessutom har vissa forskargrupper framgångsrikt utvecklat djurmodeller av EAC eller Barretts matstrupe genom att utsätta djuren för kända riskfaktorer som gastroesofageal reflux genom kirurgiska eller inflammatoriska tillvägagångssätt ^7,8,9. Dessutom utvecklades patienthärledda xenograftmodeller (PDX) som inympa EAC primära cancervävnader subkutant eller ortopiskt till immunbristfälliga möss för att simulera humant EAC-tumörbiologiskt beteende och tumörmiljö 10,11,12. Trots att dessa modeller förbättrar kliniska tillämpningar och vår förståelse av molekylära mekanismer bakom EAC-tumörigenes och progression, finns det fortfarande en stor utmaning att extrapolera resultat från dessa forskningsmodeller till människor.

Patient-härledda tumörorganoider (PDO) odlas i ett 3D-odlingssystem som efterliknar mänsklig utveckling och organregenerering in vitro. PDOs, som genereras från patienternas primära vävnad, rekapitulerar de molekylära och fenotypiska egenskaperna hos den humana tumören och har visat lovande tillämpningar inom läkemedelsutveckling och personlig cancerbehandling^13,14. Genom att jämföra tio fall av EAC-SUB med deras parade tumörvävnad rapporteras EAC-SUB dela liknande histopatologiska egenskaper och genomiska landskap med primärtumören, behålla heterogeniteten inom tumören och underlätta effektiv läkemedelsscreening in vitro¹⁵. EAC-PDO användes också för att studera interaktionen mellan EAC-tumörceller och patient-härledda cancerassocierade fibroblaster (CAF), vilket indikerar en kraftfull tillämpning inom tumörmikromiljöforskning¹⁶. Tyvärr har det funnits begränsade protokoll tillgängliga för att utveckla och sprida EAC-SUB. Här beskrivs två olika metoder för att subkulturera och bevara EAC-SUB i detalj: med och utan encellsförtunning. De standardiserade metoderna för underhåll av EAC-SUB och deras tillämpningar kan stödja forskare att välja lämpliga metoder för olika ändamål i sin EAC SUB-forskning.

Protocol

En etablerad och välväxande SUB-kultur utgör grunden för en framgångsrik subkultur och kryokonservering som beskrivs i detta protokoll. Här genererades EAC-PDO: er från EAC-patienternas primära tumörvävnad med hjälp av protokollet som beskrivs av Karakasheva T. A. et al17. EAC-vävnader samlades in från biobanken under godkännande av BioMaSOTA (godkänd av etikkommittén vid Kölns universitet, ID: 13-091). OBS: EAC-SUB har odlats i en fuktad inkubator vid …

Representative Results

Detta protokoll presenterar förfarandena inklusive subkultur och kryokonservering av EAC-SUB med och utan encellsförtunning. Figur 1 visar representativa faskontrastbilder av de två olika subkulturstrategierna. EAC PDOs nådde lämplig densitet för subkulturering (figur 1, vänster). Subkulturering utan encellsförtunning tar mindre tid att nå jämförbar densitet och leder huvudsakligen till kompakta strukturer (<strong class="x…

Discussion

I detta protokoll beskrivs två olika subkultur- och kryokonserveringsmetoder för EAC-SUB, dvs med och utan encellsförtunning. Flera studier rekommenderade passerande EAC-PDO: er med encellsförtunning^15,17, vilket är fördelaktigt för de flesta experiment som kräver cellnummerkontroll, enhetlig densitet och en ihålig struktur som underlättar storleksspårning. Den enda cellbaserade metoden kännetecknas emellertid av långsammare tillväxt efter reodling …

Materials

Equipment
-20°C Freezer	Bosch		Economic
-80°C Freezer	Panasonic		MDF DU500VH-PE
Automated Cell counter	Thermo Fisher	AMQAX1000	Countess II
Biological Safety Cabinet Class II	Thermo Scientific	51022482	Herasafe KS12
Centrifuge	Heraeus	75003060	Megafuge 1.0R
CO2 Incubator	Thermo Scientific	50116048	Heracell 150i
Inverted automated fluorescence microscope	Olympus		IX83
Inverted light microscope	Leica		DMIL LED Fluo
Pipette 1000 µL	Eppendorf	3123000063	Research Plus
Pipette 200 µL	Eppendorf	3123000039	Research Plus
Rotating Incubator	Scientific Industries, sc.	SI-1200	Enviro-genie
Shaker	Eppendorf	5355 000.011	Thermomixer Comfort
Vacuum pump	Vacuubrand	20727200	BVC control
Waterbath	Medingen	p2725	W22
Material
15 mL tube	Sarstedt	62.554.502	Inc Screw cap tube PP 15 mL
Cryo vial 2 mL	Sarstedt	72.379	CryoPure 2.0 mL tube
Low bind tube 1.5 mL	Sarstedt	72.706.600	Micro tube 1.5 mL protein LB
Low bind tube 5 mL	Eppendorf	0030 108.302	Protein LoBind Tube 5.0 mL
Pipette tip 200 µL	Starlab	E1011-8000	200 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL	Starlab	E1011-9000	1000 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL	Sarstedt	70.3050	Pipette tip 1000 µL
Sterile filter 0.2 µm	Sarstedt	83.1826.001	Filtropur 0.2 µm sterile filter
Tissue culture plate	Sarstedt	83.3921	12 well-plate
Reagent/Chemical
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
B-27	Thermo Fisher Scientific	17504001
Cell Recovery Solution	Corning	354253
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182/CS-0181
DNase I grade II, from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	10104159001
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190094
Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	356231
FGF-10a	Peprotech	100-26-100
Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium	Thermo Fisher Scientific	12648010
Gastrin	Sigma	G9020
Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL)	PromoCell	C-36030
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080
L-Glutamine 200 mM (100X)	Thermo Fisher Scientific	25030024
N-2	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165
Nicotinamide	Sigma	N0636-100
Noggin	Peprotech	120-10C-50
Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells	Biotechne	3710-001-01
SB202190	MedChemExpress	152121-30-7
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma-Aldrich	93620-1G
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Wnt-3A conditioned medium	Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group
Y-27632	Sigma	Y0503