Detta protokoll beskriver metoderna för subkultur och kryokonservering av esofageal adenokarcinomorganoider med och utan encellsförtunning för att göra det möjligt för forskare att välja lämpliga strategier baserat på deras experimentella design.
Bristen på lämpliga translationella forskningsmodeller som återspeglar primär sjukdom för att utforska tumorigenes och terapeutiska strategier är ett stort hinder i matstrupen adenokarcinom (EAC). Patient-härledda organoider (PDO) har nyligen framträtt som en anmärkningsvärd preklinisk modell i en mängd olika cancerformer. Det finns dock fortfarande begränsade protokoll tillgängliga för att utveckla EAC PDOs. När underofficerarna har fastställts är förökning och kryokonservering avgörande för ytterligare analyser nedströms. Här har två olika metoder standardiserats för EAC PDOs subkultur och kryokonservering, dvs med och utan encellsförtunning. Båda metoderna kan på ett tillförlitligt sätt erhålla lämplig cellviabilitet och är tillämpliga för en mångsidig experimentell inställning. Den aktuella studien visade att subkulturerande EAC-SUB med encellsförtunning är lämplig för de flesta experiment som kräver cellnummerkontroll, enhetlig densitet och en ihålig struktur som underlättar storleksspårning. Den enda cellbaserade metoden visar dock långsammare tillväxt i odling såväl som efter återodling från frysta lager. Dessutom kännetecknas subkulturering med encellsförtunning genom att bilda ihåliga strukturer med en ihålig kärna. Däremot är bearbetning av EAC-SUB utan encellsförtunning gynnsam för kryokonservering, expansion och histologisk karakterisering. I detta protokoll beskrivs fördelarna och nackdelarna med subkulturering och kryokonservering av EAC-SUB med och utan encellsförtunning för att göra det möjligt för forskare att välja en lämplig metod för att bearbeta och undersöka sina organoider.
Matstrupscancer (EC) är den tionde vanligaste och den sjätte vanligaste dödsorsaken i cancer världen över1. Esofagusadenokarcinom (EAC) är en av de viktigaste histologiska subtyperna av EC och förekommer främst i västländer2. Under det senaste decenniet har EAC-förekomsten ökat avsevärt i många utvecklade länder, inklusive Tyskland3. På grund av cancerns aggressivitet och bristen på symtom under det tidiga skedet av tumörutveckling är den totala prognosen hos EAC-patienter dålig, vilket visar en 5-årig överlevnad på cirka 20%2,4,5.
Sedan slutet av 1900-talet har flera modeller etablerats för EAC: s biomedicinska forskning. De klassiska humana EAC-cellinjerna som etablerades på 1990-talet6, utökar vår kunskap om EAC-tumörbiologi, tumörgenetik samt antitumörstrategier och används ofta i EAC-forskning. Dessutom har vissa forskargrupper framgångsrikt utvecklat djurmodeller av EAC eller Barretts matstrupe genom att utsätta djuren för kända riskfaktorer som gastroesofageal reflux genom kirurgiska eller inflammatoriska tillvägagångssätt 7,8,9. Dessutom utvecklades patienthärledda xenograftmodeller (PDX) som inympa EAC primära cancervävnader subkutant eller ortopiskt till immunbristfälliga möss för att simulera humant EAC-tumörbiologiskt beteende och tumörmiljö 10,11,12. Trots att dessa modeller förbättrar kliniska tillämpningar och vår förståelse av molekylära mekanismer bakom EAC-tumörigenes och progression, finns det fortfarande en stor utmaning att extrapolera resultat från dessa forskningsmodeller till människor.
Patient-härledda tumörorganoider (PDO) odlas i ett 3D-odlingssystem som efterliknar mänsklig utveckling och organregenerering in vitro. PDOs, som genereras från patienternas primära vävnad, rekapitulerar de molekylära och fenotypiska egenskaperna hos den humana tumören och har visat lovande tillämpningar inom läkemedelsutveckling och personlig cancerbehandling13,14. Genom att jämföra tio fall av EAC-SUB med deras parade tumörvävnad rapporteras EAC-SUB dela liknande histopatologiska egenskaper och genomiska landskap med primärtumören, behålla heterogeniteten inom tumören och underlätta effektiv läkemedelsscreening in vitro15. EAC-PDO användes också för att studera interaktionen mellan EAC-tumörceller och patient-härledda cancerassocierade fibroblaster (CAF), vilket indikerar en kraftfull tillämpning inom tumörmikromiljöforskning16. Tyvärr har det funnits begränsade protokoll tillgängliga för att utveckla och sprida EAC-SUB. Här beskrivs två olika metoder för att subkulturera och bevara EAC-SUB i detalj: med och utan encellsförtunning. De standardiserade metoderna för underhåll av EAC-SUB och deras tillämpningar kan stödja forskare att välja lämpliga metoder för olika ändamål i sin EAC SUB-forskning.
I detta protokoll beskrivs två olika subkultur- och kryokonserveringsmetoder för EAC-SUB, dvs med och utan encellsförtunning. Flera studier rekommenderade passerande EAC-PDO: er med encellsförtunning15,17, vilket är fördelaktigt för de flesta experiment som kräver cellnummerkontroll, enhetlig densitet och en ihålig struktur som underlättar storleksspårning. Den enda cellbaserade metoden kännetecknas emellertid av långsammare tillväxt efter reodling …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Köln Fortune Program / Medicinska fakulteten, Kölns universitet. Vi tackar den tekniska hjälpen från Susanne Neiss, Michaela Heitmann och Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo stöddes ekonomiskt av Guangzhou Elite Scholarship Council (GESC). Författarna tackar Dr. Joshua D’Rozario för hans hjälp med språklig redigering.
Equipment | |||
-20°C Freezer | Bosch | Economic | |
-80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
Material | |||
15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
Reagent/Chemical | |||
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
Gastrin | Sigma | G9020 | |
Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
Y-27632 | Sigma | Y0503 |