Subkultur og kryopræservering af esophageal adenocarcinom organoider: Fordele og ulemper ved enkeltcelle fordøjelse

Summary

Denne protokol beskriver metoderne til subkultur og kryopræservering af esophageal adenocarcinom organoider med og uden enkeltcelle fordøjelse for at gøre det muligt for forskere at vælge passende strategier baseret på deres eksperimentelle design.

Abstract

Manglen på egnede translationelle forskningsmodeller, der afspejler primær sygdom til at udforske tumorgenese og terapeutiske strategier, er en stor hindring i esophageal adenocarcinom (EAC). Patientafledte organoider (PTO’er) har for nylig vist sig som en bemærkelsesværdig præklinisk model i en række kræftformer. Der er dog stadig begrænsede protokoller til rådighed til udvikling af ØK PPO’er. Når PPO’erne er etableret, er formering og kryopræservering afgørende for yderligere downstream-analyser. Her er to forskellige metoder blevet standardiseret for EAC PPO’er subkultur og kryopræservering, dvs. med og uden enkeltcellefordøjelse. Begge metoder kan pålideligt opnå passende cellelevedygtighed og kan anvendes til en forskelligartet forsøgsopstilling. Den nuværende undersøgelse viste, at subkulturering af EAC PPO’er med enkeltcellefordøjelse er velegnet til de fleste eksperimenter, der kræver cellenummerkontrol, ensartet tæthed og en hul struktur, der letter størrelsessporing. Den enkeltcellebaserede metode viser imidlertid langsommere vækst i kultur såvel som efter gendyrkning fra frosne bestande. Desuden er subkulturering med enkeltcellefordøjelse karakteriseret ved at danne hule strukturer med en hul kerne. I modsætning hertil er behandling af EAC PTO’er uden enkeltcellefordøjelse gunstig for kryokonservering, ekspansion og histologisk karakterisering. I denne protokol beskrives fordele og ulemper ved subkulturering og kryopræservering af EAC PTO’er med og uden enkeltcellefordøjelse for at gøre det muligt for forskere at vælge en passende metode til at behandle og undersøge deres organoider.

Introduction

Spiserørkræft (EC) er den tiende mest almindelige og den sjette største dødsårsag fra kræft på verdensplan¹. Esophageal adenocarcinom (EAC) er en af de vigtigste histologiske undertyper af EF og forekommer hovedsageligt i vestlige lande². I det seneste årti er forekomsten af forhåndsræk steget betydeligt i mange udviklede lande, herunder Tyskland³. På grund af kræftens aggressivitet og manglen på symptomer i det tidlige stadium af tumorudvikling er den samlede prognose hos EAC-patienter dårlig, hvilket viser en 5-årig overlevelsesrate på ca. 20%^2,4,5.

Siden slutningen af det tyvende århundrede er der etableret flere modeller for den biomedicinske forskning i EAC. De klassiske humane EAC-cellelinjer, der blev etableret i 1990’erne⁶, udvider vores viden om EAC-tumorbiologi, tumorgenetik samt antitumorstrategier og bruges almindeligvis i EAC-forskning. Desuden har nogle forskergrupper med succes udviklet dyremodeller af EAC eller Barretts spiserør ved at udsætte dyrene for kendte risikofaktorer som gastroøsofageal refluks gennem kirurgiske eller inflammatoriske tilgange ^7,8,9. Derudover blev patientafledte xenograft (PDX) modeller, der indpodet EAC primære kræftvæv subkutant eller ortotopisk i immundefekte mus, udviklet til at simulere human EAC tumor biologisk adfærd og tumormiljø 10,11,12. På trods af disse modeller, der forbedrer kliniske anvendelser og vores forståelse af molekylære mekanismer bag EAC tumorgenese og progression, er der dog stadig en stor udfordring at ekstrapolere resultater fra disse forskningsmodeller til mennesker.

Patientafledte tumororganoider (PPO’er) dyrkes i et 3D-kultursystem, der efterligner menneskelig udvikling og organregenerering in vitro. Genereret fra patienternes primære væv rekapitulerer PPO’er de molekylære og fænotypiske egenskaber ved den humane tumor og har vist lovende anvendelser inden for lægemiddeludvikling og personlig kræftbehandling^13,14. Ved at sammenligne ti tilfælde af EAC PDO’er med deres parrede tumorvæv rapporteres EAC PDO’er at dele lignende histopatologiske træk og genomisk landskab med den primære tumor, bevare intratumorheterogenitet og lette effektiv lægemiddelscreening in vitro¹⁵. EAC PDO’er blev også brugt til at studere interaktionen mellem EAC-tumorceller og patientafledte kræftassocierede fibroblaster (CAF’er), hvilket indikerer en stærk anvendelse inden for tumormikromiljøforskning¹⁶. Desværre har der været begrænsede protokoller til rådighed til udvikling og udbredelse af ØK PPO’er. Her beskrives to forskellige metoder til at subkulturere og bevare EAC PPO’er i detaljer: med og uden enkeltcellefordøjelse. De standardiserede metoder til vedligeholdelse af EAC PDO’er og deres anvendelser kan støtte forskere i at vælge passende metoder til forskellige formål i deres EAC BOB-forskning.

Protocol

En etableret og velvoksende BOB-kultur udgør grundlaget for en vellykket subkultur og kryopræservering beskrevet i denne protokol. Her blev EAC PPO’er genereret fra EAC-patienters primære tumorvæv ved hjælp af protokollen beskrevet af Karakasheva T. A. et al17. EAC-væv blev indsamlet fra biobank under godkendelse af BioMaSOTA (godkendt af den etiske komité ved universitetet i Köln, ID: 13-091). BEMÆRK: ØK-BOB’er er blevet dyrket i en befugtet inkubator ved 37 …

Representative Results

Denne protokol præsenterer procedurerne, herunder subkultur og kryopræservering af EAC PPO’er med og uden enkeltcellefordøjelse. Figur 1 viser repræsentative fasekontrastbilleder af de to forskellige subkulturstrategier. EAC PPO’er nåede passende tæthed til subkulturering (figur 1, til venstre). Subkulturering uden fordøjelse af en enkelt celle tager mindre tid at nå sammenlignelig densitet og fører hovedsageligt til kompakte…

Discussion

I denne protokol beskrives to forskellige subkultur- og kryopræserveringsmetoder for EAC PPO’er, dvs. med og uden enkeltcellefordøjelse. Flere undersøgelser anbefalede at videregive EAC PPO’er med enkeltcellefordøjelse^15,17, hvilket er gavnligt for de fleste eksperimenter, der kræver cellenummerkontrol, ensartet tæthed og en hul struktur, der letter størrelsessporing. Den enkeltcellebaserede metode er imidlertid kendetegnet ved langsommere vækst efter rek…

Materials

Equipment
-20°C Freezer	Bosch		Economic
-80°C Freezer	Panasonic		MDF DU500VH-PE
Automated Cell counter	Thermo Fisher	AMQAX1000	Countess II
Biological Safety Cabinet Class II	Thermo Scientific	51022482	Herasafe KS12
Centrifuge	Heraeus	75003060	Megafuge 1.0R
CO2 Incubator	Thermo Scientific	50116048	Heracell 150i
Inverted automated fluorescence microscope	Olympus		IX83
Inverted light microscope	Leica		DMIL LED Fluo
Pipette 1000 µL	Eppendorf	3123000063	Research Plus
Pipette 200 µL	Eppendorf	3123000039	Research Plus
Rotating Incubator	Scientific Industries, sc.	SI-1200	Enviro-genie
Shaker	Eppendorf	5355 000.011	Thermomixer Comfort
Vacuum pump	Vacuubrand	20727200	BVC control
Waterbath	Medingen	p2725	W22
Material
15 mL tube	Sarstedt	62.554.502	Inc Screw cap tube PP 15 mL
Cryo vial 2 mL	Sarstedt	72.379	CryoPure 2.0 mL tube
Low bind tube 1.5 mL	Sarstedt	72.706.600	Micro tube 1.5 mL protein LB
Low bind tube 5 mL	Eppendorf	0030 108.302	Protein LoBind Tube 5.0 mL
Pipette tip 200 µL	Starlab	E1011-8000	200 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL	Starlab	E1011-9000	1000 µL Graduated tip, wide orifice
Pipette tip 1000 µL	Sarstedt	70.3050	Pipette tip 1000 µL
Sterile filter 0.2 µm	Sarstedt	83.1826.001	Filtropur 0.2 µm sterile filter
Tissue culture plate	Sarstedt	83.3921	12 well-plate
Reagent/Chemical
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
B-27	Thermo Fisher Scientific	17504001
Cell Recovery Solution	Corning	354253
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182/CS-0181
DNase I grade II, from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	10104159001
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190094
Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	356231
FGF-10a	Peprotech	100-26-100
Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium	Thermo Fisher Scientific	12648010
Gastrin	Sigma	G9020
Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL)	PromoCell	C-36030
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080
L-Glutamine 200 mM (100X)	Thermo Fisher Scientific	25030024
N-2	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165
Nicotinamide	Sigma	N0636-100
Noggin	Peprotech	120-10C-50
Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells	Biotechne	3710-001-01
SB202190	MedChemExpress	152121-30-7
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma-Aldrich	93620-1G
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Wnt-3A conditioned medium	Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group
Y-27632	Sigma	Y0503