Subkultur und Kryokonservierung von Ösophagus-Adenokarzinom-Organoiden: Vor- und Nachteile für die Einzelzellverdauung
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Methoden der Subkultur und Kryokonservierung von Ösophagus-Adenokarzinom-Organoiden mit und ohne Einzelzellaufschluss, um es den Forschern zu ermöglichen, geeignete Strategien auf der Grundlage ihres experimentellen Designs auszuwählen.
Abstract
Der Mangel an geeigneten translationalen Forschungsmodellen, die Primärerkrankungen widerspiegeln, um die Tumorentstehung und therapeutische Strategien zu erforschen, ist ein großes Hindernis beim Ösophagus-Adenokarzinom (EAC). Patientenabgeleitete Organoide (PDOs) haben sich kürzlich als bemerkenswertes präklinisches Modell bei einer Vielzahl von Krebsarten herausgestellt. Für die Entwicklung von EAC-PDOs stehen jedoch noch begrenzte Protokolle zur Verfügung. Sobald die g.U. etabliert sind, sind die Vermehrung und Kryokonservierung für weitere nachgelagerte Analysen unerlässlich. Hier wurden zwei verschiedene Methoden für EAC-PDOs Subkultur und Kryokonservierung standardisiert, d.h. mit und ohne Einzelzellaufschluss. Beide Methoden können zuverlässig eine geeignete Zelllebensfähigkeit erreichen und sind für einen vielfältigen Versuchsaufbau geeignet. Die aktuelle Studie zeigte, dass die Subkulturierung von EAC-PDOs mit Einzelzellaufschluss für die meisten Experimente geeignet ist, die eine Kontrolle der Zellzahl, eine gleichmäßige Dichte und eine hohle Struktur erfordern, die die Größenverfolgung erleichtert. Die Einzelzell-basierte Methode zeigt jedoch ein langsameres Wachstum sowohl in der Kultur als auch nach der Rekultivierung aus gefrorenen Beständen. Außerdem ist die Subkulturation mit einzelliger Verdauung durch die Bildung von Hohlstrukturen mit einem hohlen Kern gekennzeichnet. Im Gegensatz dazu ist die Verarbeitung von EAC-PDOs ohne Einzelzellverdauung günstig für die Kryokonservierung, Expansion und histologische Charakterisierung. In diesem Protokoll werden die Vor- und Nachteile der Subkulturierung und Kryokonservierung von EAC-PDOs mit und ohne Einzelzellaufschluss beschrieben, um es den Forschern zu ermöglichen, eine geeignete Methode zur Verarbeitung und Untersuchung ihrer Organoide zu wählen.
Introduction
Speiseröhrenkrebs (EC) ist die zehnthäufigste und die sechsthäufigste Todesursache durch Krebsweltweit 1. Das Ösophagus-Adenokarzinom (EAC) ist einer der wichtigsten histologischen Subtypen von EC und tritt hauptsächlich in westlichen Ländern auf2. In den letzten zehn Jahren hat die EAC-Inzidenz in vielen Industrieländern, einschließlich Deutschland, deutlich zugenommen3. Aufgrund der Aggressivität von Krebs und des Fehlens von Symptomen im frühen Stadium der Tumorentwicklung ist die Gesamtprognose bei EAC-Patienten schlecht und zeigt eine 5-Jahres-Überlebensrate von etwa 20%2,4,5.
Seit dem späten zwanzigsten Jahrhundert haben sich mehrere Modelle für die biomedizinische Forschung der EAC etabliert. Die klassischen humanen EAC-Zelllinien, die in den 1990er Jahren etabliert wurden6, erweitern unser Wissen über EAC-Tumorbiologie, Tumorgenetik sowie Anti-Tumor-Strategien und werden häufig in der EAC-Forschung eingesetzt. Außerdem haben einige Forschungsgruppen erfolgreich Tiermodelle der EAC oder Barrett-Speiseröhre entwickelt, indem sie die Tiere bekannten Risikofaktoren wie gastroösophagealen Reflux durch chirurgische oder entzündliche Ansätze ausgesetzt haben 7,8,9. Darüber hinaus wurden patientenabgeleitete Xenotransplantat-Modelle (PDX) entwickelt, die EAC-Primärkrebsgewebe subkutan oder orthotopisch in immundefiziente Mäuse transplantieren, um das biologische Verhalten des menschlichen EAC-Tumors und die Tumorumgebung zu simulieren10,11,12. Obwohl diese Modelle die klinischen Anwendungen und unser Verständnis der molekularen Mechanismen hinter der EAC-Tumorentstehung und -progression verbessern, besteht immer noch eine große Herausforderung, die Ergebnisse dieser Forschungsmodelle auf den Menschen zu extrapolieren.
Patientenabgeleitete Tumororganoide (PDOs) werden in einem 3D-Kultursystem gezüchtet, das die menschliche Entwicklung und Organregeneration in vitro nachahmt. Aus dem Primärgewebe der Patienten gewonnen, rekapitulieren PDOs die molekularen und phänotypischen Eigenschaften des menschlichen Tumors und haben vielversprechende Anwendungen in der Arzneimittelentwicklung und personalisierten Krebsbehandlunggezeigt 13,14. Durch den Vergleich von zehn Fällen von EAC-PDOs mit ihrem gepaarten Tumorgewebe wird berichtet, dass EAC-PDOs ähnliche histopathologische Merkmale und eine genomische Landschaft mit dem Primärtumor teilen, die Heterogenität innerhalb des Tumors beibehalten und ein effizientes Arzneimittelscreening in vitroermöglichen 15. EAC-PDOs wurden auch bei der Untersuchung der Interaktion von EAC-Tumorzellen mit patientenabgeleiteten Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs) verwendet, was auf eine leistungsstarke Anwendung im Bereich der Tumormikroumgebungsforschunghinweist 16. Leider gibt es nur begrenzte Protokolle für die Entwicklung und Verbreitung von EAC-PDOs. Hier werden zwei verschiedene Methoden zur Subkulturation und Konservierung von EAC-PDOs im Detail beschrieben: mit und ohne Einzelzellverdauung. Die standardisierten Methoden zur Aufrechterhaltung von EAC-PDOs und deren Anwendungen können Forscher dabei unterstützen, geeignete Methoden für verschiedene Zwecke in ihrer EAC-PDO-Forschung zu wählen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll werden zwei verschiedene Subkultur- und Kryokonservierungsmethoden von EAC-PDOs beschrieben, d.h. mit und ohne Einzelzellverdauung. Mehrere Studien empfahlen, EAC-PDOs mit Einzelzellverdauung15,17 zu passieren, was für die meisten Experimente von Vorteil ist, die eine Kontrolle der Zellzahl, eine gleichmäßige Dichte und eine hohle Struktur erfordern, die die Größenverfolgung erleichtert. Die Einzelzellmethode zeichnet sich jedoch durch ei…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Köln Fortune Program/Medizinische Fakultät der Universität zu Köln unterstützt. Wir danken der technischen Unterstützung von Susanne Neiss, Michaela Heitmann und Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo Fan wurde vom Guangzhou Elite Scholarship Council (GESC) finanziell unterstützt. Die Autoren danken Dr. Joshua D’Rozario für seine Unterstützung bei der linguistischen Bearbeitung.
Materials
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
Referências
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