Método de electroporación eficiente y rentable para estudiar las vías de señalización primarias dependientes del cilio en el precursor de células granulares
Summary
Aquí, presentamos un protocolo de electroporación in vitro reproducible para la manipulación genética de precursores primarios de células granulares cerebelosas (GCP) que es rentable, eficiente y viable. Además, este protocolo también demuestra un método sencillo para el estudio molecular de las vías de señalización de Hedgehog dependientes del cilio primario en células GCP primarias.
Abstract
El cilio primario es un orgánulo de señalización crítico que se encuentra en casi todas las células que transduce los estímulos de señalización de Hedgehog (Hh) desde la superficie celular. En el precursor de células granulares (GCP), el cilio primario actúa como un centro de señalización fundamental que orquesta la proliferación de células precursoras mediante la modulación de la vía de señalización de Hh. La investigación de la maquinaria de señalización de Hh dependiente del cilio primario se ve facilitada por la manipulación genética in vitro de los componentes de la vía para visualizar su localización dinámica en el cilio primario. Sin embargo, la transfección de transgenes en los cultivos primarios de GCP utilizando los métodos de electroporación actualmente conocidos es generalmente costosa y a menudo resulta en una baja viabilidad celular y una eficiencia de transfección indeseable. Este documento presenta un protocolo de electroporación eficiente, rentable y simple que demuestra una alta eficiencia de transfección de ~ 80-90% y una viabilidad óptima de la celda. Este es un método de modificación genética simple, reproducible y eficiente que es aplicable al estudio de la vía de señalización primaria de Hedgehog dependiente del cilio en cultivos primarios de GCP.
Introduction
Los GCP cerebelosos son ampliamente utilizados para estudiar la maquinaria de la vía de señalización de Hh en tipos de células progenitoras neuronales debido a su alta abundancia y alta sensibilidad a la vía de señalización de Hh de vivo1,2,3,4. En los GCP, el cilio primario actúa como un centro de transducción de señal Hh fundamental5 que orquesta la proliferación de las células precursoras6,7,8. La visualización in vitro de los componentes de señalización de Hh en el cilio primario a menudo es un desafío debido a sus bajos niveles basales endógenos. Por lo tanto, la modificación transgénica de los niveles de expresión de proteínas y el marcado de fluoróforos del gen de interés son enfoques útiles para estudiar la vía a resolución molecular. Sin embargo, la manipulación genética de cultivos primarios de GCP utilizando enfoques de transfección basados en liposomas a menudo resulta en una baja eficiencia de transfección, lo que dificulta futuras investigaciones moleculares9. La electroporación aumenta la eficiencia, pero comúnmente requiere reactivos de electroporación exorbitantes específicos del proveedor y restringidos por el tipo de celda10.
Este artículo presenta un método de electroporación de alta eficiencia y rentable para manipular los componentes de la vía de señalización de Hh en cultivos primarios de GCP. Utilizando este protocolo de electroporación modificado, un transgén suavizado marcado con proteína fluorescente verde (GFP) (pEGFP-Smo) se administró de manera eficiente a los GCP y logró altas tasas de supervivencia y transfección celular (80-90%). Además, como lo demuestra la tinción inmunocitoquímica, los GCP transfectados mostraron una alta sensibilidad a la activación inducida por agonistas suavizados de la vía de señalización de Hh mediante el tráfico de EGFP-Smo a los cilios primarios. Este protocolo será directamente aplicable y beneficioso para los experimentos que impliquen la modificación genética in vitro de tipos de células que sean difíciles de transfectar, como los cultivos de células primarias humanas y de roedores, así como las células madre pluripotentes inducidas por humanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La transfección de transgenes en cultivo primario de GCP por electroporación se asocia típicamente con baja viabilidad celular y baja eficiencia de transfección9,10. Este documento presenta un protocolo de electroporación rentable y reproducible que ha demostrado una alta eficiencia y viabilidad. Además, también demostramos un método sencillo para estudiar la vía de señalización Hh dependiente del cilio primario en células GCP primarias.
<p class=…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por HKBU Seed Fund y Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) a C.H.H. Hor.
Materials
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
Referências
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
- Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Biologia do Desenvolvimento. 270 (2), 393-410 (2004).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
- Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
- Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
- Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Biologia do Desenvolvimento. 317 (1), 246-259 (2008).
- Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
- Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
- Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
- Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , 235-247 (2014).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).
