Denne protokollen skisserer en metode for effektivt å trekke ut levende nematoder fra naturlige substrater i feltet.
Utover å være robuste eksperimentelle modellorganismer, er Caenorhabditis elegans og dens slektninger også ekte dyr som lever i naturen. Studier av ville nematoder i deres naturlige miljøer er verdifulle for å forstå mange aspekter av biologi, inkludert de selektive regimene der særegne genomiske og fenotypiske karakterer utvikler seg, det genetiske grunnlaget for kompleks egenskapsvariasjon og det naturlige genetiske mangfoldet som er grunnleggende for alle dyrepopulasjoner. Dette manuskriptet beskriver en enkel og effektiv metode for å trekke ut nematoder fra sine naturlige underlag, inkludert rotting av frukt, blomster, sopp, bladavfall og jord. Baermann traktmetode, en klassisk nematologiteknikk, isolerer selektivt aktive nematoder fra deres substrater. Fordi den gjenoppretter nesten alle aktive ormer fra prøven, gjør Baermann-traktteknikken det mulig å gjenopprette sjeldne og langsomt voksende genotyper som forekommer sammen med rikelige og raskt voksende genotyper, som kan gå glipp av i ekstraksjonsmetoder som involverer flere generasjoner reproduksjon. Teknikken er også godt egnet til å håndtere metagenetiske, befolkningsgenetiske og økologiske spørsmål. Den fanger hele befolkningen i et utvalg samtidig, noe som gir et objektivt syn på den naturlige fordelingen av aldre, kjønn og genotyper. Protokollen tillater distribusjon i stor skala i feltet, og konverterer raskt substrater til ormeplater, og forfatterne har validert den gjennom feltarbeid på flere kontinenter.
Verdifull biologisk innsikt dukker opp når forskere som studerer C. elegans i laboratoriet utvider sitt fokus til C. elegans og relaterte rhabditid nematoder i naturen. Studier av ville nematoder plasserer gener og genomer i sin naturlige kontekst, og avslører funksjoner som potensielt er skjult av laboratorieforhold1,2,3,4,5. Disse studiene genererer innsikt i forutsetningen for selve evolusjonen, genetisk variasjon6,7,8,9,10. Den naturlige genetiske variasjonen fanget av ville prøver gir også inngrep i det genetiske grunnlaget for mange komplekse egenskaper11,12,13.
Ved utforming av studier som krever isolering av naturlige populasjoner av nematoder, spesielt når man utfører fjerntliggende feltarbeid, kommer praktiske hensyn i forgrunnen. Denne protokollen tar sikte på å isolere hele populasjoner av aktive nematoder som kan dyrkes på OP50 fra agn eller ville substrater. Metoden er godt egnet for utvinning av frittlevende rabditid og diplogasterid nematoder, inkludert Caenorhabditis, Oscheius og Pristionchus.
Det er mange teknikker for å isolere nematoder fra deres substrater14,15. Den mest grunnleggende tilnærmingen er å plassere substratet direkte på en nematode-middels plate, plukke dyr når de kryper ut8,15. Denne metoden krever store mengder tid og arbeidskraft hvis målet er å isolere alle nematoder fra et utvalg. Mer sofistikerte teknikker drar nytte av dyrenes vekt, størrelse, mobilitet eller en kombinasjon av disse14. Hver metode har sine fordeler og ulemper når det gjelder oppsett og gjennomstrømning. De varierer også i prøvetakingsbiasene og kan velge for visse nematoder hvis dyrene i prøven varierer langs aksen til metodens separasjonsprinsipp.
Baermann-traktmetoden ble først beskrevet i 1917 av den nederlandske legen G. K. T. F. Baermann, som oppfant enheten på Java mens han studerte jordboende nematoder, inkludert den parasittiske krokormen16. Baermann-trakten fungerer basert på mobilitetsprinsippet. Substratet er plassert i en trakt foret med en klut eller et papirfilter (en “Kimwipe” brukes til denne studien, referert til som “lofri klut” i den nåværende protokollen) og forseglet lukket nederst. Trakten fylles deretter med vann, senker prøven mens filteret skiller den fra det forseglede uttaket. Aktive nematoder i prøven slipper seg ut i vannet og svømmer gjennom filteret, og legger seg til slutt på bunnen av trakten. Traktutløpet åpnes, og en dråpe nematoder utvises på en plate (figur 1).
Figur 1: Oppsummering av Baermann-traktteknikken. (A) Innsamling av en bakterierik prøve fra et interessested. (B) Senke prøven i en Baermann-trakt og vente på at ormer skal vri seg ut og synke. (C) Løsne en enkelt dråpe fra trakten. (D) Flytte enkelthermafroditter eller parrede kvinner for å skille plater. Illustrasjon laget av Ramin Rahni. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Baermann-trakten vil ikke fungere for alle slags nematoder (se diskusjonsseksjonen for spesifikke alternativer) og passer best til de som er aktive former i størrelsesområdet caenorhabditt eller mindre14. Men hvis en studie kan bruke Baermann-trakten, er det mange fordeler. Metoden er praktisk i -feltet, noe som krever begrenset oppsett, praktisk tid og kostnad. Forskeren sitter igjen med en ren prøve uten hindring av substratet på platen, noe som gjør det enkelt å plukke. Bruk av et filter forhindrer også forurensning av platen av insektslarver eller kvaler, som tygger opp plater eller bytter på nematoder i prøven. Viktigst av alt trekker Baermann-trakten effektivt ut nesten hele befolkningen fra substratet14, noe som kan være nødvendig avhengig av studiens design. For eksempel kan forskere som er interessert i å telle ville populasjoners stadium eller kjønnsfordeling, finne langsomt voksende eller sjeldne genotyper, eller prøvetaking av nematoder som ikke er tiltrukket av OP50, dra nytte av denne metoden. Dette er egnet for forskere som studerer økologiske17, populasjonsgenetikk18 eller metagenetiske19 spørsmål, da prøvetakingsordningen tar et øyeblikksbilde av befolkningen på prøvetakingstidspunktet.
Det nåværende manuskriptet beskriver en komplett protokoll for isolering av populasjoner av nematoder ved hjelp av Baermann-trakten og etablering av isofemale- og isohermafrodittlinjer i feltet, ved hjelp av utstyr valgt for enkel transport. For forskere som utfører feltarbeid i nærheten av laboratoriene sine, kan mange av disse trinnene utelates eller forenkles.
Det sentrale prinsippet for denne metoden er at nematoder vil passere gjennom vevet nedsenket i vann, mens deres substrat og større hvirvelløse forurensninger ikke vil. De kritiske trinnene i protokollen er (1) å samle et passende substrat, (2) nedsenke substratet, pakket inn i et filtreringsmateriale, i vann, (3) samle ormer som har gått gjennom filteret og senket til bunnen av vannet, og (4) isolere individuelle ormer for å lage isofemale- eller isohermafrodittlinjer. Alle andre deler av metoden kan endres etter behov i henhold til tilgjengelige ressurser, substratenes art eller feltarbeidsmålene. Noen modifikasjoner som er verdt å vurdere er som følger.
Baiting ormene ved å plante frukt
Hvis det ikke er rikelig med tilførsel av bakterierikt råtnende materiale som finnes på feltstedet, kan man ønske å ta med en prøve, for eksempel et stykke eple eller tomat, for å la det råtne. Fest agnet godt med noen få innsatser slik at større dyr ikke fjerner dem, og slik at det lett kan bli funnet senere for innsamling. Unngå direkte sollys, hvor agn kan tørke før det råtner.
Konstruksjon av traktapparat ut av de materialene som er tilgjengelige
Enhver struktur med hull som er store nok til å imøtekomme rørklemmen og stabil nok til å støtte en topptung trakt, vil fungere. For en enkelt trakt er et drikkeglass en passende holder. Alle typer vev – ansiktsvev, toalettpapir eller papirhåndklær – kan brukes.
Sette mindre materiale i trakter, eller justere ventetiden, for å forhindre hypoksi eller infeksjon
Hvis prøven har en svært høy konsentrasjon av ormer eller bakterier, kan nematoder begynne å dø av hypoksi eller infeksjon før inkubasjonen på 12 timer er fullført. Hvis dette er en bekymring, kan forskeren sjekke trakter tidligere eller forberede en ekstra trakt med et svært lite undersampler av det høyt befolkede substratet.
Justering av NGM-platepreparatet til eksperimentelle behov og begrensninger
NGM-plater kan tilberedes med alle medier og matkilder som passer til eksperimentet. Feltprotokollen som er beskrevet ovenfor, er utformet for å minimere bagasjevekten. Avhengig av bagasjebegrensninger og tidspunkt for feltarbeid, kan det være å foretrekke å ta med allerede hellede NGM-plater – enten tilberedt i laboratoriet eller kjøpt kommersielt – i stedet for å helle plater i felten.
Utføre traktisolasjonene i laboratoriet
Protokollen beskriver å utføre hele prosedyren under feltforhold for å fange nematodepopulasjonen slik den forekommer i naturen. For noen forskningsmål kan det være tilstrekkelig å isolere nematoder senere, etter å ha reist tilbake til laboratoriet med prøver i forseglede poser. Selv da gir Baermann-traktmetoden en renere og fullstendig prøve av de overlevende nematodene enn andre isolasjonsmetoder. Prøver i forseglede poser kan imidlertid oppleve valg under reise, da de utsettes for potensielle ekstreme temperaturer og hypoksi. Dette kan minimeres ved å utføre isolasjoner så snart som mulig etter prøveinnsamling.
En vanlig alternativ metode til Baermann-trakten innebærer å plassere substratet direkte på en NGM-plate og vente på at ormer skal krype ut, noe som enten er svært arbeidskrevende eller resulterer i den ufullstendige samlingen av befolkningen. Det gir også plater forurenset med kvaler og insekt larver. Baermann-traktmetoden er en rimelig, lavteknologisk lavarbeidsstrategi for raskt å skille hele befolkningen av aktive ormer fra deres substrat.
Baermann traktmetode er ikke universelt anvendelig for å samle alle typer ville nematoder. Noen planteboende nematoder tar mye lengre tid enn 12 timer å komme ut av sitt substrat og vil være fraværende fra et dråpe utgitt for tidlig, mens noen insektsparasitter vil krype til toppen av trakten i stedet for bunnen, og også unngå samling14. Alternativer til Baermann-trakten krever enten mer spesialisert utstyr eller mer arbeidskraft for å gjenopprette ormene. Imidlertid kan de fortsatt foretrekkes hvis forbeholdene ovenfor er et problem for eksperimentet. Alternative alternativer, gjennomgått av van Bezooijen14, inkluderer traktspraymetoden, som gir en konstant tåke av vann til trakter, legger oksygen og tillater overløp av bakterier i suspensjon. Dette gir en lengre utvinningsperiode av nematoder fra planter. Blender sentrifugal flotasjonsmetoden gjenoppretter sakte bevegelige, inaktive eller oppadgående krypende nematoder ved å skille dem med deres spesifikke tyngdekraft, Oostenbrink-elutriatoren bruker en understrøm for å skille sediment fra suspenderte nematoder, og Cobbs metode bruker en rekke sikter for å isolere nematoder etter størrelse, form og sedimenteringshastighet14. For å samle rhabditider produserer Baermann-trakten rene prøver raskt og med minimal innsats.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd R35GM141906 og R21ES031364 og Damon Runyon Fellowship DRG-2371-19.
1 L glass bottle | NA | NA | Step 1 – vessel for making plate media |
1 mL pipette tips | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
1 mL pipetter | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
35 mm worm plates | Tritech | T3500 | Step 1 – worm plates |
4mm ID rubber tubing | Fisher | 14178A | Step 3 – part of the funnel |
60 mm worm plates | Greiner | 628161 | Step 1 – worm plates |
65 mm Funnel | Fisher | 22170156 | Step 3 – part of the funnel |
Calcium chloride | Fisher | C79-500 | Step 1 – worm plate medium |
Cooking pot | NA | NA | Step 1 – a water bath for melting the agar to pour plates |
E. coli strain OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Step 1 – worm food |
Field microscope | OMAX | G223CS | Step 6 – for viewing worms in the field |
Fly vial storage tray | Azer Scientific | ES-260T | Step 3 – to build a platform to hold 12 funnels |
Hot plate or stove | NA | NA | Step 1 – to heat the water bath |
Kimwipes | KimberlyClark | 34120 | Step 4 – filter for the funnels |
LB media | Gibco | 10855021 | Step 1 – for growing OP50 |
Lighter | NA | NA | Step 6 – sterilize the worm pick |
Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Step 1 – worm plate medium |
NGM-lite agar | USBiological | N1000 | Step 1 – worm plate medium |
Parafilm M wrapping film | Fisher | 13-374-10 | Step 6 – pack worm plates for travel |
Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-500 | Step 1 – worm plate medium |
Potassium phosphate monobasic | Fisher | P285-3 | Step 1 – worm plate medium |
scalpel | NA | NA | Step 3 – cut holes for the funnels |
scissors | NA | NA | Step 3 – cut the rubber tubing |
Tape | NA | NA | Step 3 – tape the funnel holder together |
Tubing clamps | Fisher | 5869 | Step 3 – part of the funnel |
Worm pick | NA | NA | Step 6 – for isolating individual worms |
Ziplock-style storage bags | NA | NA | Step 2 – to bag a substrate sample |