Neste protocolo, é descrito um modelo de colite de transferência de células T específica de microbiota intestinal. As células T CD4+ são isoladas de camundongos transgênicos CBir1 TCR. Estes são específicos para um antígeno de microbiota intestinal imunodominante CBir1 flagellin, que é transferido para camundongos Rag1-/- receptores, levando à inflamação intestinal.
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Artigo de método
Indução da Inflamação Intestinal por Transferência Adotiva de Células CD4+ T Transgênicas CBir1 T para camundongos imunodeficientes
Neste artigo
Resumo
Resumo
Com o aumento da incidência, as doenças inflamatórias intestinais (DII), que são doenças crônicas que afetam o trato gastrointestinal, impõem uma considerável carga sanitária e financeira aos indivíduos e à sociedade. Por isso, é fundamental investigar os mecanismos subjacentes à patogênese e ao desenvolvimento do IBD. Aqui, um modelo de colite de transferência de células T específica de microbiota intestinal é descrito. CBir1 flagellin foi reconhecido como o antígeno bacteriano intestinal imunodominante em colite experimental e pacientes com doença de Crohn. As células CD4+ T transgênicas CBir1 T, específicas do CBir1 flagellin, podem induzir colite crônica após transferência adotiva para rag1-/- camundongos deficientes imunológicos. A gravidade da doença é avaliada pela histopatologia. Os fenótipos de células T CD4+ em lavíria lamina colonia também são determinados. Este modelo se assemelha muito ao desenvolvimento do IBD, que fornece um modelo murino ideal para investigar os mecanismos que conduzem a patogênese do IBD e testar os potenciais medicamentos para o tratamento do DII.
Introdução
As doenças inflamatórias intestinais (DII), principalmente incluindo a doença de Crohn (CD) e a colite ulcerativa (UC), são caracterizadas pela inflamação crônica, reencenando-reencenação do trato gastrointestinal, afetando milhões em todo o mundo1. Vários fatores foram implicados no desenvolvimento e na patogênese do DII, incluindo suscetibilidade genética, microbiota intestinal, respostas imunes, dieta e estilo de vida2. No entanto, o mecanismo exato do IBD ainda não é completamente compreendido.
Um dos interesses particulares é a interação entre microbiota intestinal e respostas imunes hosp....
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Protocolo
Todos os procedimentos animais foram realizados de acordo com o Comitê de Uso e Cuidado dos animais da Universidade do Texas Medical Branch. Os ratos CBir1 TCR Tg foram fornecidos pelo Dr. Charles Elson da Universidade do Alabama em Birmingham. Os camundongos CBir1 TCR Tg podem ser fêmeas ou machos, mas devem estar entre 8 e 12 semanas. Os camundongos rag1-/- no fundo C57BL/6 foram obtidos do Laboratório Jackson10. Os camundongos devem ser compatível com sexo e idade, e homens ou mulheres podem ser usados, mas devem ter entre 8 e 12 semanas. Todo o protocolo está resumido na Figura 1....
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Resultados
Aproximadamente 5 x 106 CBir1 TCR Tg na camiseta CD4+ células T por baço foram isoladas de um rato CBir1 TCR Tg adulto. Transferência de células CBir1 TCR Tg naic4+ T induzidas colite crônica em rag1-/- camundongos receptores. Após a transferência celular, foram monitorados sinais clínicos para avaliar a progressão da inflamação intestinal, incluindo perda de peso, consistência das fezes e postura curvada. Como esperado, os camundongos começaram a perder peso em torno .......
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Discussão
Embora cada passo seja essencial para a reprodutibilidade desse modelo de colite, existem várias etapas críticas. Os camundongos rag-/- receptores devem receber células INV4+ inválidas adequadas para induzir inflamação intestinal. Usamos baços para o isolamento de células T CD4+ ingênuas em vez de MLNs. Porque o rendimento de células T CD4+ ingênuas em MLNs é muito menor do que em baços. CD62L é altamente expresso em células T ingênuas, e CD44 e CD25 são os marcadores .......
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Divulgações
Nenhum autor tem interesses financeiros, profissionais ou pessoais conflitantes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado em parte pelos subsídios do National Institutes of Health DK125011, AI150210 e DK124132, o prêmio STARs do Sistema da Universidade do Texas (Y.C.), e o James W. McLaughlin Fellowship Fund da University of Texas Medical Branch em Galveston (W.Y.). A Figura 1 foi criada com BioRender.com.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,22 µ m filtro superior de garrafa descartável acionado a vácuo | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicilina-Estreptomicina | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µ m filtro | BD Biosciences | 352360 | |
| Pipeta de transferência de 3 mL | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | ||
| Partículas Magnéticas CD4 Anti-Mouse | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE / Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Contador de Células Automatizado | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Tubo C | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Ímã de Separação de Células | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Máquina Dissociadora | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0,5 M, PH 8,0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R& D Systems | S11550 | |
| Citômetro de fluxo | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxilina e Eosina (H& E) Kit de coloração | Abcam | ab245880 | |
| Seringas de insulina | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomicina | ThermoFisher | I24222 | |
| Kit de coloração de células mortas de infravermelho próximo fixável vivo/morto | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Agitadores empilháveis incubados/refrigerados | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-miristato 13-acetato | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Classificador | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Processador Automático | ThermoFisher | STP120 | |
| de Incorporação/Processamento de Tecidos | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| Conjunto de Buffer de Fator de Transcrição True-Nuclear (incluindo Buffer de Perm) | Biolegend | 424401 |
Referências
- Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).
- Ananthakrishnan, A. N. Epidemiology and risk factors for IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12
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Reimpressões e permissões
