Hier leveren we exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsingen aan de nier via staartaderinjectie van een niet-virale vector en polyethylenimine nanodeeltjes in verschillende nierziektemuismodellen. Dit leidde tot significante overexpressie van doelmiRNA in de nier, wat resulteerde in geremde progressie van nierziekte in verschillende muismodellen.
microRNA’s (miRNA’s), kleine niet-coderende RNA’s (21-25 basen) die niet worden vertaald in eiwitten, remmen veel doelboodschapper-RNA’s (mRNA’s) door hun vertaling bij verschillende nierziekten te destabiliseren en te remmen. Daarom is afwisseling van miRNA-expressie door exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsingen een potentieel nuttige behandelingsoptie voor het remmen van de ontwikkeling van veel nierziekten. Omdat serumRNAase echter onmiddellijk systematisch toegediende exogene miRNA-nabootsingen in vivo afbreekt, blijft de afgifte van miRNA aan de nier een uitdaging. Daarom zijn vectoren nodig die exogene miRNA-nabootsingen kunnen beschermen tegen afbraak door RNAase en ze aanzienlijk aan de nier kunnen afleveren. Veel studies hebben virale vectoren gebruikt om exogene miRNA-nabootsers of -remmers aan de nier te leveren. Virale vectoren kunnen echter een interferonrespons en/of genetische instabiliteit veroorzaken. Daarom is de ontwikkeling van virale vectoren ook een hindernis voor het klinische gebruik van exogene miRNA-nabootsers of -remmers. Om deze zorgen met betrekking tot virale vectoren weg te nemen, ontwikkelden we een niet-virale vectormethode om miRNA-nabootsingen aan de nier af te leveren met behulp van staartaderinjectie van polyethylenimine nanodeeltjes (PEI-NP’s), wat leidde tot significante overexpressie van doel-miRNA’s in verschillende muismodellen van nierziekte.
miRNA’s, kleine niet-coderende RNA’s (21-25 basen) die niet worden vertaald in eiwitten, remmen veel doelboodschapper-RNA’s (mRNA’s) door ze te destabiliseren en hun vertaling bij verschillende nierziekten te remmen 1,2. Daarom is gentherapie met exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsers of -remmers een potentiële nieuwe optie om de ontwikkeling van veel nierziekten te remmen 3,4,5.
Ondanks de belofte van miRNA-nabootsers of -remmers voor gentherapie, blijft levering aan doelorganen een grote hindernis voor in vivo experimenten om hun klinische potentieel te ontwikkelen. Omdat kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsers of -remmers onderhevig zijn aan onmiddellijke afbraak door serum-RNase, wordt hun halfwaardetijd verkort bij systemische toediening in vivo6. Bovendien is de efficiëntie van miRNA-nabootsers of -remmers om het plasmamembraan en transfect cytoplasma te passeren over het algemeen veel lager zonder geschikte vectoren 7,8. Deze bewijslijnen suggereren dat de ontwikkeling van het miRNA-nabootsings- of remmersysteem voor de nier nodig is om het gebruik ervan in klinische omgevingen mogelijk te maken en ze een nieuwe behandelingsoptie te maken voor patiënten met verschillende nierziekten.
Virale vectoren zijn gebruikt als dragers om exogene miRNA-nabootsers of -remmers aan de nier te leveren 9,10. Hoewel ze zijn ontwikkeld voor bioveiligheid en transfectie-werkzaamheid, kunnen virale vectoren nog steeds een interferonrespons en / of genetische instabiliteit veroorzaken11,12. Om deze zorgen weg te nemen, ontwikkelden we een miRNA-nabootsingssysteem voor de nier met behulp van polyethylenimine nanodeeltjes (PEI-NP’s), een niet-virale vector, in verschillende muismodellen van nierziekte13,14,15.
PEI-NP’s zijn lineaire op polymeren gebaseerde NP’s die oligonucleotiden, inclusief miRNA-nabootsers, effectief aan de nier kunnen afleveren en worden beschouwd als de voorkeur voor het bereiden van niet-virale vectoren vanwege hun veiligheid op lange termijn en biocompatibiliteit13,16,17.
Deze studie toont de effecten aan van systematische exogene miRNA-nabootsing toediening met PEI-NP’s via staartaderinjectie in nierfibrosemodelmuizen geproduceerd door unilaterale ureterobstructie (UUO). Daarnaast demonstreren we de effecten van systematische exogene miRNA-nabootsing met PEI-NP’s via staartaderinjectie in diabetische nierziektemodelmuizen (db / db-muizen: C57BLKS / J Iar -+ Lepr db / + Leprdb) en acute nierbeschadigingsmodelmuizen geproduceerd door nierischemie-reperfusieletsel (IRI).
Met behulp van het protocol dat in dit manuscript wordt gepresenteerd, kunnen PEI-NP’s miRNA-nabootsingen aan de nier leveren om overexpressie van doel-miRNA’s te induceren, wat resulteert in behandelingseffecten in in vivo muismodellen van verschillende nierziekten, waaronder nierfibrose, diabetische nierziekte en AKI.
De methode om het complex van PEI-NP’s en miRNA-mimiek te bereiden is heel eenvoudig. Het positief geladen oppervlak van PEI-NP’s vangt de miRNA-nabootsing in wanneer …
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door JSPS KAKENHI (Grant No. 21K08233). Wij danken Edanz (https://jp.edanz.com/ac) voor het redigeren van kladversies van dit manuscript.
4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |