トランスクリプトームレベルでのヒト原発性腸間膜動脈内皮細胞の単離とプロファイリング
Summary
プロトコルは、ヒト腸間膜動脈からの内皮細胞の単離、培養、およびプロファイリングを記載している。さらに、空間トランスクリプトミクスのためにヒト動脈を調製する方法が提供される。プロテオミクス、トランスクリプトミクス、および機能アッセイは、単離された細胞に対して行うことができる。このプロトコルは、任意の中型または大型の動脈に転用することができる。
Abstract
内皮細胞(EC)は、環境の手がかりに対する動的な応答を通じて、血管および全身の機能にとって重要です。ECのトランスクリプトームとエピゲノムを解明することは、発達、健康、疾患におけるECの役割を理解する上で最も重要ですが、単離された初代細胞の利用可能性は限られています。最近の技術により、ECトランスクリプトームとエピゲノムのハイスループットプロファイリングが可能になり、これまで知られていなかったEC細胞亜集団や発生軌跡の同定につながっています。EC培養はECの機能および機能不全の探索において有用なツールであるが、培養条件および複数の継代は、形態、エピジェネティック状態、および遺伝子発現プログラムを含む天然ECの特性を変化させる外部変数を導入する可能性がある。この限界を克服するために、本稿は、ヒト原発ECをドナー腸間膜動脈から単離し、その本来の状態を捕捉することを目指して実施する方法を実証する。内膜層のECは、特定の酵素の使用により機械的および生化学的に解離する。得られた細胞は、バルクRNAまたは単一細胞RNAシーケンシングに直接使用することも、培養のために播種することもできます。さらに、空間トランスクリプトーム、特に市販のプラットフォームのためのヒト動脈組織の調製のためのワークフローが記載されているが、この方法は他の空間トランスクリプトームプロファイリング技術にも適している。この方法論は、内皮細胞生物学の極めて重要な側面であるEC転写およびエピジェネティック調節に関する洞察を得るために、健康状態または疾患状態の様々なドナーから収集された異なる血管に適用することができる。
Introduction
血管の内腔を裏打ちする内皮細胞(EC)は、血管緊張および組織灌流の重要な調節因子である。ECは、細胞外環境に反応し、血流のダイナミクスと組成の変化に適応する能力において顕著です。これらの動的応答は、時空間分解能を有する転写および転写後調節を含む細胞内シグナル伝達事象のネットワークを介して媒介される。これらの応答の調節不全は、心血管疾患、糖尿病、および癌を含むがこれらに限定されない多くの病状に関与している1,2。
研究の大部分は、ECトランスクリプトームを調査するために細胞株または動物モデルを利用しています。前者は、比較的使いやすさと安価さを考えると、便利なツールです。しかし、逐次培養は、線維芽細胞の特徴や分極の欠如などの表現型変化をECに導入し、ECをin vivo状態から切り離す可能性があります3。初代細胞、例えばヒト臍帯静脈EC(HUVEC)は、1980年代から一般的な選択肢であったが、成人には存在しない発達血管床に由来するため、成熟ECを完全に表す可能性は低い。動物、特にマウスモデルは、ECの生理学的または病態生理学的環境をよりよく表し、遺伝的摂動の結果としてトランスクリプトームの尋問を可能にする。マウスECは、酵素ベースの手順4、5、6、7を用いて、大動脈、肺、および脂肪組織を含む様々な組織から単離することができる。しかしながら、単離された細胞は、形質転換6でない限り複数の継代に使用することができず、しばしば数が限られており、複数の動物からのプーリング5、8、9を必要とする。
トランスクリプトームレベルで、特に単一細胞分解能で血管構造を探索する新技術の出現は、ECの新規機能および特性を明らかにすることによって内皮生物学の新時代を可能にした5、10、11、12、13、14。Tabula Murisの研究者によって構築された豊富なリソースは、20の異なるマウス器官にわたるECを含む100,000細胞の単一細胞トランスクリプトームプロファイルを収集し15、共通のECマーカー遺伝子と、組織間および組織内の違いを伴うユニークなトランスクリプトームシグネチャの両方を明らかにした5,13。それにもかかわらず、ゲノム、エピゲノム、およびトランスクリプトームにおいて、特に非コード領域において、マウスとヒトとの間には明確な違いがある16、17、18。これらの前述の欠点は、健康と病気における本来の状態にあるECの忠実なプロファイルを得るために、ヒトサンプルを用いたECの分析の重要性を強調している。
ほとんどのEC単離方法は、タンパク質分解酵素とのインキュベーション前に、均質化、細かく切断、および組織を細かく切断することによる物理的解離に依存しています。酵素および状態はまた、トリプシンからコラゲナーゼまで、組織タイプによってもかなり異なり、単独でまたは組み合わせて使用される19、20、21。さらなる抗体ベースの濃縮または精製は、ECの純度を高めるためにしばしば含まれる。典型的には、EC膜マーカー、例えばCD144およびCD31に対する抗体は、磁気ビーズにコンジュゲートされ、細胞懸濁液22、23に添加される。このような戦略は、一般に、このプロトコールで導入された技術を含む、複数のヒトおよびマウス組織からのEC単離に適合させることができる。
ECは、その本来の状態では、複数の細胞型と相互作用し、細胞の近接性が機能にとって重要である血管ニッチに存在する可能性がある。単一細胞および単一核RNAシーケンシング(scRNAおよびsnRNA-seq)研究は、ECの不均一性を記述する上での最近のブレークスルーにとって最も重要であったが、解離プロセスは組織コンテキストおよび細胞間接触を混乱させ、EC生物学を理解する上でも重要である。2012年に開発され、2020年にメソッド・オブ・ザ・イヤー24と名付けられた空間トランスクリプトームプロファイリングは、脳25、腫瘍26、脂肪組織27を含む様々な組織の空間的特徴を保持しながら、グローバルな遺伝子発現をプロファイリングするために利用されてきた。これらの技術は、アフィニティー試薬または蛍光タグに結合した特定のRNA配列に特異的な特殊なプローブを使用して標的とすることができ、したがって、細胞内分解能28、29、30、31で選択された遺伝子を検出する。それらはまた、非標的化32、33、典型的には空間的にバーコードされたオリゴヌクレオチドを使用してRNAを捕捉し、それらは一緒になってその後の配列ライブラリー調製のためにcDNAに変換され、したがって、偏りのない方法で組織全体の遺伝子発現を推定するという利点を有する。しかしながら、空間分解能は、現在、市販の技術では単一セルラーレベルでは達成されていない。これは、scRNA-seqデータとのデータ統合によってある程度克服することができ、最終的には、元の空間情報を保持しながら、複雑な組織コンテキストにおける単一細胞トランスクリプトームのマッピングを可能にする34。
本明細書では、血管拡張、血管リモデリング、酸化ストレス、および炎症を研究するために使用されている末梢動脈であるヒト上腸間膜動脈を用いてECトランスクリプトームをプロファイルするワークフローが記載されている35、36、37。2つの技術が記載されている:1)単一細胞トランスクリプトームシーケンシングまたはその後のインビトロ培養に適した機械的解離および酵素消化を組み合わせた血管の内膜からECを単離および濃縮する;2)空間トランスクリプトームプロファイリング用の動脈切片を作製した(図1)。これら2つの手法は、ECとその周囲の細胞をプロファイリングするために、独立してまたは相補的に実行することができる。さらに、このワークフローは、任意の中動脈または大動脈での使用に適合させることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示されたワークフローは、単一の細胞および空間分解能を有する単一のヒト動脈からECをプロファイルするための一連の技術を詳述する。プロトコルにはいくつかの重要なステップと制限要因があります。トランスクリプトームプロファイリングの鍵の1つは、組織の新鮮さとRNAの完全性です。RNAの分解を最小限に抑えるために、処理前にできるだけ氷上の組織を維持することが重要です。?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NIH助成金R01HL108735、R01HL145170、R01HL106089(Z.B.C.へ)によって支援されました。DP1DK126138およびDP1HD087990(S.Z.へ);エラ・フィッツジェラルド財団の助成金とワネク・ファミリー・プロジェクト(Z.B.C.へ)ヒト細胞アトラス種子ネットワーク助成金(Z.B.C.およびS.Z.に)。この出版物で報告された研究には、米国国立衛生研究所の国立がん研究所が支援するCity of Hopeの統合ゲノミクスコアで行われた研究が含まれ、賞番号P30CA033572で行われました。著者らは、ヒト組織の単離のためのシティ・オブ・ホープの膵島移植チームのイスマイル・アル・アブドラ博士とメイリゲン・チー博士、scRNA-seq解析の支援に対するシティ・オブ・ホープのDongqiang Yuan博士、およびジョンズ・ホプキンス大学医学部心臓血管病理学部門のMarc Halushka博士に、血管組織学に関する彼の貴重な洞察に感謝したい。
Materials
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 10 cm dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 23G needles | BD | 305145 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | AC327270010 | |
| 40 µm strainer | Fisher | 14100150 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent Technologies | G2991BA | |
| 5 mL tube | Thermo Fisher | 14282300 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 07-000-208 | |
| Attachment factor | Cell Applications | 123-500 | Attachment reagent in the protocol |
| Black wax | Any commercial black wax can be used | ||
| Bovine serum albumin heat shock treated | Fisher | BP1600-100 | |
| CaCl2 | Fisher | BP510 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Chloroform | Fisher | C607 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Cryostat brushes | |||
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | MT25950CQC | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Bacteria-derived protease in the protocol |
| Disposable Safety Scalpels | Myco Instrumentation | 6008TR-10 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | 14080055 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | 10437028 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-100g | |
| High sensitivity D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5603 | |
| High sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Incubator | Kept at 37 °C 5% CO2 | ||
| Isopropanol | Fisher | BP26324 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520-10X | |
| Metal cannister | |||
| Microscope | Leica | To assess cell morphology | |
| Microvascular endothelial culture medium | Cell Applications | 111-500 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker | Eppendorf | ||
| Optimal Cutting Temperature compound | Fisher | 4585 | |
| Plastic cryomolds | Fisher | 22363553 | |
| RNA screen tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| RNA screen Tape sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5577 | |
| RNase ZAP | Thermo Fisher | AM9780 | |
| RNase-free water | Takara | RR036B | RNase-free water (2) in kit |
| Sterile 12" long forceps | F.S.T | 91100-16 | |
| Sterile fine forceps | F.S.T | 11050-10 | |
| Sterile fine scissors | F.S.T | 14061-11 | |
| Superfrost PLUS Gold Slides | Fisher | 1518848 | |
| TRIzol reagent | Fisher | 15596018 | |
| Trypan Blue | Corning | MT25900CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red | Thermo Fisher | 12605010 | Cell-dissociation enzyme in the protocol |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000215 | |
| Visium Gateway Package, 2rxns | 10X Genomics | PN-1000316 | |
| Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000184 |
Referências
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