Isolement et profilage des cellules endothéliales artérielles mésentériques primaires humaines au niveau du transcriptome
Summary
Le protocole décrit l’isolement, la culture et le profilage des cellules endothéliales de l’artère mésentérique humaine. En outre, une méthode est fournie pour préparer l’artère humaine à la transcriptomique spatiale. La protéomique, la transcriptomique et les tests fonctionnels peuvent être effectués sur des cellules isolées. Ce protocole peut être réutilisé pour n’importe quelle artère de taille moyenne ou grande.
Abstract
Les cellules endothéliales (CE) sont cruciales pour le fonctionnement vasculaire et du corps entier grâce à leur réponse dynamique aux signaux environnementaux. L’élucidation du transcriptome et de l’épigénome des CE est primordiale pour comprendre leur rôle dans le développement, la santé et la maladie, mais est limitée dans la disponibilité de cellules primaires isolées. Les technologies récentes ont permis le profilage à haut débit du transcriptome et de l’épigénome EC, conduisant à l’identification de sous-populations de cellules EC et de trajectoires de développement auparavant inconnues. Alors que les cultures EC sont un outil utile dans l’exploration de la fonction et du dysfonctionnement EC, les conditions de culture et les multiples passages peuvent introduire des variables externes qui modifient les propriétés de l’EC native, y compris la morphologie, l’état épigénétique et le programme d’expression des gènes. Pour surmonter cette limitation, le présent article démontre une méthode d’isolement des CE primaires humains des artères mésentériques des donneurs visant à capturer leur état natif. Les CE dans la couche intimale sont dissociés mécaniquement et biochimiquement avec l’utilisation d’enzymes particulières. Les cellules résultantes peuvent être directement utilisées pour le séquençage de l’ARN en vrac ou de l’ARN unicellulaire ou plaquées pour la culture. En outre, un flux de travail est décrit pour la préparation de tissu artériel humain pour la transcriptomique spatiale, en particulier pour une plate-forme disponible dans le commerce, bien que cette méthode convienne également à d’autres techniques de profilage du transcriptome spatial. Cette méthodologie peut être appliquée à différents vaisseaux collectés auprès d’une variété de donneurs dans des états de santé ou de maladie pour mieux comprendre la régulation transcriptionnelle et épigénétique de la CE, un aspect central de la biologie des cellules endothéliales.
Introduction
Tapissant la lumière des vaisseaux sanguins, les cellules endothéliales (CE) sont des régulateurs cruciaux du tonus vasculaire et de la perfusion tissulaire. Les CE sont remarquables dans leur capacité à réagir à l’environnement extracellulaire et à s’adapter aux changements dans la dynamique et la composition du flux sanguin. Ces réponses dynamiques sont médiées par un réseau d’événements de signalisation intracellulaire, y compris des modulations transcriptionnelles et post-transcriptionnelles avec une résolution spatio-temporelle. Le dérèglement de ces réponses est impliqué dans de nombreuses pathologies, y compris, mais sans s’y limiter, les maladies cardiovasculaires, le diabète et le cancer 1,2.
Une grande partie des études utilisent des lignées cellulaires ou des modèles animaux pour interroger le transcriptome EC. Le premier est un outil utile, compte tenu de la relative facilité d’utilisation et du faible coût. Cependant, la culture en série peut introduire des altérations phénotypiques des CE, telles que des caractéristiques fibroblastiques et un manque de polarisation, les déconnectant de leur état in vivo 3. Les cellules primaires, par exemple la veine ombilicale humaine EC (HUVEC) ont été un choix populaire depuis les années 1980, mais sont dérivées d’un lit vasculaire développemental qui n’existe pas chez les adultes, donc peu susceptible de représenter pleinement les CE matures. Les animaux, en particulier les modèles murins, représentent mieux l’environnement physiologique ou physiopathologique des CE et permettent l’interrogation des transcriptomes à la suite d’une perturbation génétique. Les CE murins peuvent être isolés de divers tissus, y compris l’aorte, les poumons et les tissus adipeux à l’aide de procédures à base d’enzymes 4,5,6,7. Cependant, les cellules isolées ne peuvent pas être utilisées pour plusieurs passages à moins d’être transformées6 et sont souvent limitées en nombre, ce qui nécessite une mise en commun de plusieurs animaux 5,8,9.
L’avènement de nouvelles technologies explorant l’architecture des vaisseaux au niveau transcriptomique, en particulier avec la résolution unicellulaire, a permis une nouvelle ère de la biologie endothéliale en révélant de nouvelles fonctions et propriétés des CE 5,10,11,12,13,14. Une riche ressource construite par les chercheurs de Tabula Muris a recueilli des profils transcriptomiques unicellulaires de 100 000 cellules, y compris des CE, dans 20 organes murins différents15, qui ont révélé à la fois des gènes marqueurs EC communs et des signatures transcriptomiques uniques avec des différences inter-tissus et intra-tissulaires 5,13. Néanmoins, il existe des différences claires entre la souris et l’homme dans le génome, l’épigénome et le transcriptome, en particulier dans les régions non codantes 16,17,18. Ces inconvénients susmentionnés soulignent l’importance de l’analyse des CE à l’aide d’échantillons humains afin d’obtenir un profil fidèle des CE dans leur état d’origine en matière de santé et de maladie.
La plupart des méthodes d’isolement EC reposent sur la dissociation physique par homogénéisation, coupe fine et hachage du tissu avant l’incubation avec des enzymes protéolytiques pendant des périodes différentes. Les enzymes et les conditions varient également considérablement d’un type de tissu à l’autre, de la trypsine à la collagénase, utilisée seule ou en combinaison 19,20,21. D’autres enrichissements ou purifications à base d’anticorps sont souvent inclus pour augmenter la pureté des CE. En règle générale, les anticorps dirigés contre les marqueurs membranaires EC, par exemple CD144 et CD31, sont conjugués à des billes magnétiques et ajoutés à la suspension cellulaire22,23. Une telle stratégie peut généralement être adaptée pour l’isolement EC de plusieurs tissus humains et murins, y compris les techniques introduites dans ce protocole.
Dans leur état natif, les CE interagissent avec plusieurs types de cellules et peuvent exister dans des niches vasculaires où la proximité cellulaire est cruciale pour la fonction. Bien que les études sur le séquençage de l’ARN unicellulaire et mononucléaire (scRNA et snRNA-seq) aient été primordiales pour les récentes percées dans la description de l’hétérogénéité EC, le processus de dissociation perturbe le contexte tissulaire et le contact cellule-cellule, qui sont également importants pour comprendre la biologie EC. Développé en 2012 et nommé Méthode de l’année en 202024, le profilage du transcriptome spatial a été utilisé pour profiler l’expression globale des gènes tout en conservant les caractéristiques spatiales dans divers tissus, notamment le cerveau25, la tumeur26 et le tissu adipeux27. Les technologies peuvent être ciblées, en utilisant des sondes spécialisées spécifiques pour des séquences d’ARN particulières attachées à des réactifs d’affinité ou à des étiquettes fluorescentes, détectant ainsi des gènes sélectionnés à une résolution subcellulaire 28,29,30,31. Ils peuvent également être non ciblés32,33, utilisant généralement des oligonucléotides à code-barres spatiaux pour capturer l’ARN, qui sont convertis en ADNc pour la préparation ultérieure de la bibliothèque seq et ont donc l’avantage de déduire l’expression des gènes des tissus entiers de manière impartiale. Cependant, la résolution spatiale n’est actuellement pas atteinte à un seul niveau cellulaire avec les technologies disponibles dans le commerce. Cela peut être surmonté dans une certaine mesure avec l’intégration des données avec les données scRNA-seq, permettant finalement la cartographie du transcriptome unicellulaire dans un contexte tissulaire complexe tout en conservant ses informations spatiales d’origine34.
Ici, un flux de travail est décrit pour profiler le transcriptome EC en utilisant l’artère mésentérique supérieure humaine, une artère périphérique qui a été utilisée pour étudier la vasodilatation, le remodelage vasculaire, le stress oxydatif et l’inflammation 35,36,37. Deux techniques sont décrites: 1) isoler et enrichir les CE à partir de l’intima des vaisseaux sanguins combinant dissociation mécanique et digestion enzymatique adaptée au séquençage du transcriptome unicellulaire ou à la culture in vitro ultérieure; 2) préparer des sections artérielles pour le profilage du transcriptome spatial (Figure 1). Ces deux techniques peuvent être réalisées indépendamment ou de manière complémentaire pour profiler les CE et leurs cellules environnantes. De plus, ce flux de travail peut être adapté pour une utilisation sur n’importe quelle artère moyenne ou grande.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le flux de travail présenté détaille un ensemble de techniques pour profiler les CE à partir d’un seul morceau d’artère humaine avec une résolution unicellulaire et spatiale. Il y a plusieurs étapes critiques et facteurs limitatifs dans le protocole. L’une des clés du profilage du transcriptome est la fraîcheur du tissu et l’intégrité de l’ARN. Il est important de maintenir les tissus sur la glace autant que possible avant le traitement afin de minimiser la dégradation de l’ARN. En règle généra…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (à Z.B.C.); DP1DK126138 et DP1HD087990 (à S.Z.); une subvention de la Fondation Ella Fitzgerald et un projet de la famille Wanek (à Z.B.C.); et une subvention du réseau de semences Human Cell Atlas (à Z.B.C. et S.Z.). Les recherches rapportées dans cette publication comprenaient des travaux effectués dans le noyau de génomique intégrative de City of Hope soutenu par le National Cancer Institute des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution P30CA033572. Les auteurs aimeraient remercier le Dr Ismail Al-Abdullah et le Dr Meirigeng Qi de l’équipe de transplantation d’îlots de City of Hope pour l’isolement des tissus humains, le Dr Dongqiang Yuan de City of Hope pour son aide à l’analyse scRNA-seq, et le Dr Marc Halushka de la Division de pathologie cardiovasculaire de la Faculté de médecine de l’Université Johns Hopkins pour ses connaissances inestimables en histologie vasculaire.
Materials
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 10 cm dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 23G needles | BD | 305145 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | AC327270010 | |
| 40 µm strainer | Fisher | 14100150 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent Technologies | G2991BA | |
| 5 mL tube | Thermo Fisher | 14282300 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 07-000-208 | |
| Attachment factor | Cell Applications | 123-500 | Attachment reagent in the protocol |
| Black wax | Any commercial black wax can be used | ||
| Bovine serum albumin heat shock treated | Fisher | BP1600-100 | |
| CaCl2 | Fisher | BP510 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Chloroform | Fisher | C607 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Cryostat brushes | |||
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | MT25950CQC | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Bacteria-derived protease in the protocol |
| Disposable Safety Scalpels | Myco Instrumentation | 6008TR-10 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | 14080055 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | 10437028 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-100g | |
| High sensitivity D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5603 | |
| High sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Incubator | Kept at 37 °C 5% CO2 | ||
| Isopropanol | Fisher | BP26324 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520-10X | |
| Metal cannister | |||
| Microscope | Leica | To assess cell morphology | |
| Microvascular endothelial culture medium | Cell Applications | 111-500 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker | Eppendorf | ||
| Optimal Cutting Temperature compound | Fisher | 4585 | |
| Plastic cryomolds | Fisher | 22363553 | |
| RNA screen tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| RNA screen Tape sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5577 | |
| RNase ZAP | Thermo Fisher | AM9780 | |
| RNase-free water | Takara | RR036B | RNase-free water (2) in kit |
| Sterile 12" long forceps | F.S.T | 91100-16 | |
| Sterile fine forceps | F.S.T | 11050-10 | |
| Sterile fine scissors | F.S.T | 14061-11 | |
| Superfrost PLUS Gold Slides | Fisher | 1518848 | |
| TRIzol reagent | Fisher | 15596018 | |
| Trypan Blue | Corning | MT25900CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red | Thermo Fisher | 12605010 | Cell-dissociation enzyme in the protocol |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000215 | |
| Visium Gateway Package, 2rxns | 10X Genomics | PN-1000316 | |
| Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000184 |
Referências
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