एडिपोसाइट्स से जुड़े विकारों का अध्ययन करने के लिए एडिपोसाइट्स की शुद्ध आबादी में मानव आईपीएससी का मजबूत भेदभाव
Summary
प्रोटोकॉल प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से एक शुद्ध एडिपोसाइट आबादी की पीढ़ी की अनुमति देता है। रेटिनोइक एसिड का उपयोग आईपीएससी को मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) में अलग करने के लिए किया जाता है जिसका उपयोग एडिपोसाइट्स के उत्पादन के लिए किया जाता है। फिर, शुद्ध एडिपोसाइट्स प्राप्त करने के लिए नील लाल धुंधलापन पर आधारित एक सॉर्टिंग दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है।
Abstract
प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) प्रौद्योगिकी में हालिया प्रगति ने एडिपोसाइट्स सहित विभिन्न सेल प्रकारों की पीढ़ी की अनुमति दी है। हालांकि, वर्तमान भेदभाव विधियों में कम दक्षता है और एडिपोसाइट्स की समरूप आबादी का उत्पादन नहीं करते हैं। यहां, हम उच्च उपज में मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) का उत्पादन करने के लिए एक ऑल-ट्रांस रेटिनोइक-आधारित विधि का उपयोग करके इस समस्या को दरकिनार करते हैं। सेल प्रसार, अस्तित्व और आसंजन को नियंत्रित करने वाले मार्गों को विनियमित करके, हमारी भेदभाव रणनीति भ्रूण निकायों (ईबी) की कुशल पीढ़ी की अनुमति देती है जो मल्टीपोटेंट एमएससी की शुद्ध आबादी में अंतर करती है। इस विधि द्वारा उत्पन्न एमएससी की उच्च संख्या एडिपोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए एक आदर्श स्रोत प्रदान करती है। हालांकि, एडिपोसाइट्स भेदभाव से उत्पन्न नमूना विषमता एक चुनौती बनी हुई है। इसलिए, हमने एफएसीएस का उपयोग करके लिपिड-असर परिपक्व एडिपोसाइट्स को शुद्ध करने के लिए नील लाल-आधारित विधि का उपयोग किया। इस सॉर्टिंग रणनीति ने हमें कम नमूना विषमता और बढ़ी हुई सेल कार्यक्षमता के साथ एडिपोसाइट्स के पूल का उपयोग करके एडिपोसाइट्स से जुड़े चयापचय विकारों को मॉडल करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका स्थापित करने की अनुमति दी।
Introduction
मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) एडिपोसाइट्स, ओस्टियोसाइट्स और चोंड्रोसाइट्स जैसे मेसोडर्मल मूल की कोशिकाओं के उत्पादन के लिए एक प्रभावी क्षणभंगुर संसाधन के रूप में कार्य करते हैं, जिनका उपयोग आगे उनके संबंधित आनुवंशिक विकारों के मॉडलिंग के लिए किया जा सकता है। हालांकि, पिछले दृष्टिकोण वयस्क ऊतकों से इन एमएससी को प्राप्त करने पर निर्भर थे1, जिसने उन्हें दाताओं से उच्च संख्या में प्राप्त करने की चुनौती दी, और उन्हें इन विट्रो कल्चर स्थितियों में कार्यात्मक रूपसे व्यवहार्य रखने की सीमा 1,2। इन बाधाओं ने इन विट्रो में एमएससी उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल होने की एक बड़ी मांग पैदा की है। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) का उपयोग एमएससी के मूल्यवान स्रोत के रूप में किया जा सकता है, जो एमएससी विशेषताओं 3,4,5 का प्रदर्शन करता है। आईपीएससी-व्युत्पन्न एमएससी का उपयोग कई बीमारियों में चिकित्सीय विकल्प के रूप में किया जा सकता है। इसके अलावा, एडिपोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए आईपीएससी-व्युत्पन्न एमएससी की क्षमता, उन्हें मानव एडिपोजेनेसिस, मोटापे और एडिपोसाइट्स से जुड़े विकारों का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान इन विट्रो मानव मॉडल बनाती है।
एडिपोसाइट्स के वर्तमान विभेदन प्रोटोकॉल को दो समूहों में वर्गीकृत किया जा सकता है, जिसमें से एक में रासायनिक या प्रोटीन-आधारित कॉकटेल का उपयोग करके एडिपोसाइट्स के भेदभाव को शामिल किया जाता है, जिससे 30% -60% 6,7,8,9 की परिणामी उपज मिलती है, जबकि दूसरे में 80% -90% की उपज देने के लिए एडिपोसाइट्स विकास को नियंत्रित करने वाले प्रमुख प्रतिलेखन कारकों के मजबूत प्रेरण के लिए आनुवंशिक हेरफेर शामिल है। 11. हालांकि, आनुवंशिक हेरफेर एडिपोसाइट्स भेदभाव की प्राकृतिक प्रक्रिया को पुन: उत्पन्न नहीं करता है, और अक्सर एडिपोजेनेसिस के दौरान आने वाले सूक्ष्म प्रतिमानों को मुखौटा करता है, जिससे यह रोग मॉडलिंग उद्देश्यों के लिए अप्रभावी हो जाता है12,13. इसलिए, हम नील लाल रंग का उपयोग करके लिपिड-असर एडिपोसाइट्स को फ्लोरोसेंटली टैग करके अपरिपक्व लोगों से रासायनिक रूप से व्युत्पन्न परिपक्व एडिपोसाइट्स को सॉर्ट करने का एक तरीका प्रस्तुत करते हैं।
यहां हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें सभी ट्रांस रेटिनोइक एसिड के साथ आईपीएससी व्युत्पन्न भ्रूण निकायों (ईबी) के क्षणिक इनक्यूबेशन शामिल हैं ताकि तेजी से प्रसार एमएससी की एक उच्च संख्या का उत्पादन किया जा सके, जिसका उपयोग एडिपोसाइट्स14 उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। हम लिपोफिलिक डाई का उपयोग करके उनके लिपिड बूंदों को फ्लोरोसेंटली टैग करके विषम भेदभाव पूल से रासायनिक रूप से व्युत्पन्न परिपक्व एडिपोसाइट्स को सॉर्ट करने का एक तरीका भी प्रस्तुत करते हैं; नील लाल। यह परिपक्व एडिपोसाइट्स की शुद्ध आबादी की पीढ़ी को बढ़ी हुई कार्यक्षमता के साथ एडिपोसाइट्स से जुड़े चयापचय विकारों को सटीक रूप से मॉडल करने की अनुमति देगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल उच्च उपज और दक्षता में एमएससी प्रदान करने की अपनी क्षमता के कारण सर्वोपरि महत्व रखता है। एमएससी का यह बड़े पैमाने पर उत्पादन आरए14,15 के 10 μM के साथ आईपीएससी-व्युत्पन्न ई…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को कतर राष्ट्रीय अनुसंधान कोष (क्यूएनआरएफ) (अनुदान संख्या एनपीआरपी 10-1221-160041) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। मरियम अघाड़ी को कतर नेशनल रिसर्च फंड (क्यूएनआरएफ) से जीएसआरए छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Adiponectin | Abcam | ab22554 | Adipocyte maturation marker |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC differentiation marker |
| anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC differentiation marker |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC differentiation marker |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC differentiation marker |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC differentiation marker |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 |
MSC differentiation marker |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC differentiation marker |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC differentiation marker |
| bFGF | R&D | 233-FP | MSC culture media supplement |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | Adipocyte maturation marker |
| Dexamethasone | Torics | 1126 | Adipocyte differentiation media supplement |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | Adipocyte maturation marker |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10082147 | MSC culture media supplement |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC culture media supplement |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | Adipocyte differentiation media supplement |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Basal media for preparing matrigel |
| Low glucose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC culturing media |
| Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
| MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte differentiation media |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Sorting marker for adipocyte |
| Penicillin | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte media supplement |
| Phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190144 | wash buffer |
| Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | wash buffer |
| PPARG | Cell Signaling Technology | 2443 | Adipocyte maturation marker |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Dissociation reagent |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625 | MSC differentiation media supplement |
| Rock inhibitor | Tocris | 1254/10 | hPSC culture media supplement |
| Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Adipocyte differentiation media supplement |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC culture media |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | Permebealization reagent |
| Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | Dissociation reagent |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Wash buffer |
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