Культивирование, рост и жизнеспособность молочнокислых бактерий: перспектива контроля качества
Summary
Оценка качества культур молочнокислых бактерий (LAB) была подтверждена как эффективный способ повышения жизнеспособности и функциональности штаммов LAB для процедур ферментации. Чтобы подкрепить это утверждение, мы разработали протокол, который разъясняет, как LAB-культуры активируются и культивируются для ферментации и биообработки.
Abstract
Молочнокислые бактерии (LAB) являются важными молочными заквасочными культурами, которые в значительной степени используются для производства ферментированных молочных продуктов, таких как йогурт и сыр. LAB преимущественно производят молочную кислоту в качестве основного конечного продукта ферментации, и они синтезируют важные метаболиты, которые придают органолептические характеристики ферментированных пищевых продуктов. LAB – это привередливые бактерии, которые процветают во многих средах, когда удовлетворяются адекватные потребности в питании. Спрос на превосходные молочные заквасочные культуры LAB для ферментации в пищевой и молочной промышленности привел к необходимости обеспечения жизнеспособных и активных культур для всех операций по биообработке. Таким образом, разработка стандартного протокола для обеспечения жизнеспособности и расширенной функциональности лабораторных культур в лабораторных условиях, а также в средах переработки молочных продуктов имеет очень важное значение. При решении проблем, связанных с реанимационными слабыми, напряженными и травмированными клетками культуры LAB, протокол, который ярко описывает основные шаги по восстановлению, усилению регенерации клеток и улучшению метаболической функциональности штаммов LAB, имеет первостепенное значение. Поддержание чистоты, функциональности и жизнеспособности культур для заквасок LAB также имеет решающее значение. Таким образом, соблюдение уникального руководства по протоколу приведет к повышению производительности ферментации для многих штаммов LAB, предназначенных для процессов ферментации и биотехнологии. В результате Лаборатория пищевой микробиологии и биотехнологии в Сельскохозяйственном и техническом государственном университете Северной Каролины разработала стандартный протокол для активации и контроля качества отдельных штаммов LAB, что привело к созданию высокофункциональных и жизнеспособных штаммов культуры LAB, используемых для исследований ферментации. Адаптация и рекомендация такого протокола для использования в молочной и пищевой промышленности поможет обеспечить жизнеспособность и функциональность LAB для многих применений.
Introduction
Молочнокислые бактерии (LAB) представляют собой группу уникально разнообразных бактерий, обладающих промышленным потенциалом. Штаммы, принадлежащие Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus и Streptococcus thermophilus, в основном используются в качестве молочных заквасок для ферментированных молочных пищевых продуктов, таких как йогурт1. Выбранные штаммы LAB также классифицируются как пробиотики, поскольку они приносят пользу для здоровья людей при адекватном введении доз2. Молочнокислые бактерии также являются грамположительными, неспорообразующими, недыхающимися, но аэротолерантными микроорганизмами, которые обычно характеризуются производством молочной кислоты в качестве ключевого продукта ферментации. LAB также синтезирует эссенциальные метаболиты, например, органические кислоты, бактериоцины и другие антимикробные соединения3, которые могут ингибировать широкий спектр патогенов пищевого происхождения4. Молочная кислота, основной конечный продукт углеводного катаболизма и побочный продукт ферментации LAB, является органическим метаболитом, который обладает антимикробными свойствами и потенциально полезен для применения в биоконсервации пищевых продуктов 3,5,6. Кроме того, органические кислоты, производимые LAB, придают вкус, текстуру и аромат пищевых продуктов, тем самым усиливая их общие органолептические свойства 5,6. Различные потребности в питании LAB в сочетании с их вездесущей природой в конечном итоге позволяют бактериям легко процветать в различных средах, таких как молочные продукты, ферментированные продукты, овощи, а также в кишечнике человека7.
Существует растущий спрос на заквасочные культуры из LAB для производства йогурта и многих разнообразных молочных применений 8,9, поэтому следует придерживаться критического внимания и установленных научных методов при выращивании штаммов LAB, а также при активации как лиофилизированных, так и изолированных штаммов, поскольку эта активность жизненно важна для повышения производительности ферментации. Поэтому лаборатория пищевой микробиологии и биотехнологии активно участвует в разработке подходящей технологии, ориентированной на активацию, превосходный рост и ферментацию, характерные для штаммов LAB, выделенных из ферментированных молочных продуктов, а также из промышленных заквасок, используемых для производства йогурта. Кроме того, следует отметить, что промышленно произведенные штаммы культуры LAB подвергаются консервирующим действиям, таким как сублимационная сушка и замороженное хранение, вызывая клеточный стресс и травмы, в результате процесса холодного шока они подвергаются10. При ограничении проблем жизнеспособности и улучшении функциональности штаммов LAB, полученных либо из изолированных пищевых продуктов, либо из сублимированных продуктов, важно правильно активировать эти культуры в качестве формы контроля качества для улучшения их ферментативной характеристики8. В этом исследовании цель состояла в том, чтобы разработать собственный протокол контроля качества для активации и роста штаммов культуры L. delbrueckii subsp. bulgaricus, который в конечном итоге способствовал жизнеспособному росту LAB, а также улучшал эффективность ферментации и метаболическую функциональность штаммов LAB. Этот протокол в конечном итоге может быть адаптирован (с использованием оптимальных питательных сред и соответствующих условий культивирования) для выращивания других штаммов LAB для исследований ферментации, а также для промышленных целей или операций биообработки. Таким образом, этот протокол активации LAB и контроля качества обеспечит получение и потенциальное функционирование высококачественных молочных заквасочных культур для различных применений в мировой молочной и пищевой промышленности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Результаты всех штаммов, оцененных с помощью протокола контроля качества и без использования протокола, были одинаковыми, и поэтому были представлены результаты, связанные только с штаммами (S9 и LB6). Активированные штаммы LAB имели превосходный рост клеток, который характеризовался высо…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта публикация стала возможной благодаря грантовому номеру NC. X-267-5-12-170-1 от Национального института продовольствия и сельского хозяйства (NIFA) и частично от NIZO Food Research BV, Нидерланды, Jarrow Formulas, США, а также Департамента семейных и потребительских наук и Сельскохозяйственной исследовательской станции в Сельскохозяйственном и техническом государственном университете Северной Каролины (Гринсборо, Северная Каролина, США 27411). Эта работа также была поддержана, в частности, грантом Программы по наращиванию потенциала 1890 года No (2020-38821-31113 /присоединение к проекту No 021765). Эта работа также была частично поддержана Министерством образования и науки Болгарии в рамках Национальной исследовательской программы «Здоровое питание для сильной биоэкономики и качества жизни», утвержденной DCM # 577 / 17.08.2018.
Materials
| Aniline Blue | Thermo Scientific | R21526 | 25 g |
| Beef extract | Research Products International | 50-197-7509 | 500 g |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Calcium Chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | 500 g |
| Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP350500 | 500 g |
| D-Fructose | ACROS Organics | AC161355000 | 500 g |
| Difco agar powder | Difco | DF0812-07-1 | 2 kg |
| TPY agar | Difco | 211921 | 500 g |
| Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock) | Fisher Scientific | 05-402-12 | 2 mL |
| Glycerol | Thermo Scientific | PI17904 | 500 mL |
| Infrared CO2 Incubator | Forma Scientific | ||
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 11842 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | S9 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | LB6 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | DAW | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | E22 | |
| Lactobacillus reuteri | Biogai, Raleigh / Food Microbiology and Biotechnology Laboratory (NCATSU) | RD2 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Maltose monohydrate | Fisher Scientific | M75-100 | 100 g |
| MRS broth | Neogen | 50-201-5691 | 5 kg |
| Peptone No. 3 | Hach | 50-199-6719 | 500 g |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Research Products International | 50-712-761 | 500 g |
| Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | S220-1 | 1 kg |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | 1 kg |
| Sodium pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | 100 g |
| Test Tubes with Rubber-Lined Screw Caps | Fisher Scientific | FB70125150 | 25 x 150 mm |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | 500 mL |
| Ultra low freezer | So-Low | ||
| Uracil | ACROS Organics | AC157301000 | 100 g |
| UV- visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Evolution 201 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | ||
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| Ethanol | Fisher Scientific | T08204K7 | 4 L |
| Hydrochloric Acid (6N (Certified), Fisher Chemical) | Fisher Scientific | SA56-500 | 500 mL |
Referências
- Karakas-Sen, A., Karakas, E. Isolation, identification and technological properties of lactic acid bacteria from raw cow milk. Bioscience Journal. 34 (2), 385-399 (2018).
- Martin, R., Langella, P. Emerging health concepts in the probiotics field: Streamlining the definitions. Frontiers in Microbiology. 10, 1047 (2019).
- Sadishkumar, V., Jeevaratnam, K. In vitro probiotic evaluation of potential antioxidant lactic acid bacteria isolated from idli batter fermented with Piper betle leaves. International Journal of Food Science & Technology. 52 (2), 329-340 (2017).
- Ayivi, R. D., et al. Lactic acid bacteria: Food safety and human health applications. Dairy. 1 (3), 202-232 (2020).
- Quinto, E. J., et al. Probiotic lactic acid bacteria: A review. Food and Nutrition Sciences. 5 (18), 1765-1775 (2014).
- Hayek, S. A., Gyawali, R., Aljaloud, S. O., Krastanov, A., Ibrahim, S. A. Cultivation media for lactic acid bacteria used in dairy products. Journal of Dairy Research. 86 (4), 490-502 (2019).
- Bintsis, T. Lactic acid bacteria as starter cultures: An update in their metabolism and genetics. Aims Microbiology. 4, 665-684 (2018).
- Shao, Y., Gao, S., Guo, H., Zhang, H. Influence of culture conditions and preconditioning on survival of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus ND02 during lyophilization. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1270-1280 (2014).
- Aryana, K. J., Olson, D. W. A 100-year review: Yogurt and other cultured dairy products. Journal of Dairy Science. 100 (12), 9987-10013 (2017).
- Kandil, S., El Soda, M. Influence of freezing and freeze-drying on intracellular enzymatic activity and autolytic properties of some lactic acid bacterial strains. Advances in Microbiology. 5 (6), 371-382 (2015).
- Malairuang, K., Krajang, M., Sukna, J., Rattanapradit, K., Chamsart, S. High cell density cultivation of Saccharomyces cerevisiae with intensive multiple sequential batches together with a novel technique of fed-batch at cell level (FBC). Processes. 8 (10), 1321 (2020).
- Jeanson, S., Floury, J., Gagnaire, V., Lortal, S., Thierry, A. Bacterial colonies in solid media and foods: A review on their growth and interactions with the micro-environment. Frontiers in Microbiology. 6, 1284 (2015).
- Oyeniran, A., et al. A modified reinforced clostridial medium for the isolation and enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus in a mixed culture. Journal of Dairy Science. 103, 5030-5042 (2020).
- Iguchi, A., et al. Effects of repeated subculturing and prolonged storage at room temperature of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 on pulsed-field gel electrophoresis profiles. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 3079-3081 (2002).
- Hayek, S. A., Ibrahim, S. A. Current limitations and challenges with lactic acid bacteria: a review. Food and Nutrition Sciences. 4 (11), 73-87 (2013).
- Ahmed, S. A., Ibrahim, S. A., Kim, C., Shahbazi, A. Significance of bile salt tolerant Lactobacillus reuteri. Proceedings of the 2007 National Conference on Environmental Science and Technology. , 17-23 (2009).
- Gyawali, R., et al. A comparative study of extraction techniques for maximum recovery of β-galactosidase from the yogurt bacterium Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Research. 87 (1), 123-126 (2020).
- Nwamaioha, N. O., Ibrahim, S. A. A selective medium for the enumeration and differentiation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Science. 101 (6), 4953-4961 (2018).
