Detta protokoll beskriver ett nytt bröstavbildningsfönster med ett utbytbart lock (R.MIW). Intravital mikroskopi efter implantation av R.MIW möjliggör longitudinell och flerdagarsavbildning av den friska och sjuka bröstkörteln med en cellulär upplösning under de olika utvecklingsstadierna.
Bröstkörtelns grenade struktur är mycket dynamisk och genomgår flera faser av tillväxt och ombyggnad efter födseln. Intravital mikroskopi i kombination med hudflikkirurgi eller implantation av avbildningsfönster har använts för att studera dynamiken hos den friska bröstkörteln i olika utvecklingsstadier. De flesta bröstavbildningstekniker är begränsade till en tidsram på timmar till dagar, medan majoriteten av ombyggnadsprocesserna för bröstkörteln sker inom tidsramar från dagar till veckor. För att studera ombyggnad av bröstkörteln krävs metoder som möjliggör optisk åtkomst till vävnaden av intresse för längre tidsramar. Här beskrivs en förbättrad version av titandäggdjurets avbildningsfönster med ett utbytbart lock (R.MIW) som möjliggör högupplöst avbildning av bröstkörteln med en cellulär upplösning i upp till flera veckor. Viktigt är att R.MIW ger vävnadsåtkomst under hela det intravitala avbildningsexperimentet och kan därför användas för lokal vävnadsmanipulation, märkning, läkemedelsadministration eller bildstyrd mikrodissektion. Sammantaget möjliggör R.MIW högupplöst karakterisering av celldynamiken under bröstkörtelutveckling, homeostas och sjukdom.
Bröstepitelet är ett unikt sekretoriskt organ som finns hos däggdjur, som producerar och utsöndrar mjölk för att ge näring åt avkommor. Under hela livet genomgår bröstkörteln flera omgångar av utveckling och tillväxt, som åtföljs av strukturella och funktionella förändringar i vävnaden1. Beroende på utvecklingsstadiet är celltyperna som bidrar till vävnadsombyggnad olika, liksom platsen i duktalträdet.
Multifoton intravital mikroskopi (IVM) möjliggör studier av bröstcelldynamik in vivo i den ursprungliga och minimalt störda inställningen 2,3,4. För att få visuell tillgång till bröstkörteln har flera tillfälliga ex vivo- eller hudflikavbildningstekniker publicerats under olika stadier av bröstkörtelutveckling, inklusive puberteten 4,5,6,7, vuxen ålder 2,8, laktation 9,10,11,12 och tumördynamik 13,14 ,15. Även om dessa tekniker resulterar i hög rumsligt och tidsmässigt upplöst avbildning av bröstcelldynamik, är tidsramen begränsad till timmar medan de flesta ombyggnadsprocesser för bröstkörteln tar dagar till veckor. Därför krävs metoder som möjliggör optisk åtkomst till vävnaden av intresse för förlängda tidsramar. Under årens lopp har flera permanenta bildfönster utvecklats för brösttumöravbildning 15,16,17,18, inklusive ett titandäggdjursavbildningsfönster (MIW)2,3,19. Även om det var mycket användbart för att studera brösttumörtillväxt, förblev visualiseringen av den friska bröstkörtelstrukturen begränsad till några dagar. Nyligen utvecklades ett flexibelt kiselavbildningsfönster som möjliggör visualisering av pubertal bröstkörtel under flera veckor20. Bröstkörteln är emellertid inbäddad i en adipocytrik fettkudde, vilket leder till omfattande ljusspridning och som ett resultat begränsad synlighet av bröstduktstrukturen. Därför krävs överlägsna avbildningsförhållanden hela tiden för att visualisera vävnadsdynamiken under längre tidsperioder i bröstkörteln. Varken den klassiska MIW eller det flexibla kiselfönstret möjliggör vävnadsmanipulation eller optimering av fysisk vävnadsplats före avbildning, eftersom fönstret bildar ett slutet system efter operation och implantation. Som ett resultat kommer optimal optisk tillgång till den underliggande bröstvävnaden sannolikt att uteslutas under längre tidsperioder. Däremot möjliggör hudklafftekniken optimering och ompositionering av vävnaden under avbildningssessionen och en hudflik kan upprepas flera gånger2. Upprepade avbildningssessioner genom en hudklaff är dock endast möjliga när tillräcklig tid (minst 7 dagar) fördelas mellan operationer för att möjliggöra återhämtning av huden och är därför mest lämpad för att studera processer på längre tidsskalor. Dessutom är det lämpligt att inte utföra denna procedur många gånger på grund av dess invasiva natur och stor risk för infektioner och ärrbildning vid sårstängning.
För att övervinna dessa begränsningar, dvs. för att säkerställa optimala avbildningsförhållanden under en längre tidsperiod vid hög frekvens och samtidigt tillåta vävnadsmanipulation, utformades en förbättrad titanversion av MIW med ett utbytbart lock (R.MIW) för att visualisera den friska och sjuka bröstkörteln under flera dagar till veckor2 (figur 1A, B). R.MIW var specialdesignad för att ge optimal vävnadsåtkomst, vilket möjliggör direkt vävnadsmanipulation under hela IVM-experimentets varaktighet och därmed möjliggör visualisering av bröstkörteln vid rätt tidpunkt och plats under längre tidsperioder. När den är stängd bildar R.MIW ett lufttätt system som är jämförbart med den klassiska MIW (figur 1C). När R.MIW öppnas under aseptiska förhållanden tillåter R.MIW lokal vävnadsmanipulation för att förbättra optisk åtkomst och möjliggör också lokal administrering av ämnen, såsom väghämmare eller agonister, injektion av olika celltyper av intresse, såsom cancercells- eller immuncellpopulationer, eller tillsats av vävnadsmärkningsfärgämnen. Locket kan öppnas när som helst mellan bildsessionerna utan att orsaka skador på den underliggande vävnaden.
Figur 1: Utformning av bröstavbildningsfönstret med ett utbytbart lock. (B) Övre vy och sidovy av bröstavbildningsfönstret, som består av en yttre ring och en inre ring med ett spår däremellan för att säkra fönstret i musens hud med hjälp av en plånbokssträng sutur. Den yttre ringen har ett litet spår som passar lockets fyra utsprång (armar). (C) Tecknad film och bilder som visar lockets öppnings- och stängningsmekanismer. De sneda utsprången ser till att locket är fixerat inuti fönsterkarmen. Denna siffra har modifierats från Messal m.fl. 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Detta protokoll beskriver design- och implantationsproceduren för R.MIW, liksom en longitudinell IVM-strategi för att återbesöka samma bröstkanaler och deras visualisering med en cellulär upplösning. R.MIW gör det möjligt att följa celldelningar och morfologiska förändringar under olika utvecklingsfaser av bröstkörteln i olika fluorescerande reportermusmodeller. Sammantaget underlättar R.MIW högupplöst karakterisering av celldynamiken under bröstkörtelutveckling, homeostas och sjukdom.
R.MIW möjliggör longitudinell avbildning av den friska och sjuka bröstkörteln i sin ursprungliga och minimalt störda miljö och möjliggör upprepad visualisering av bröstkörteln i olika utvecklingsstadier. R.MIW-designen gör att fönstret kan öppnas när som helst under experimentet. Långsiktig visuell tillgång till vävnaden av intresse kan hindras, till exempel genom ackumulering av cellskräp på täckglaset. I sådana fall kan R.MIW öppnas före eller omedelbart efter en avbildningssession för att möjliggöra rengöring av hela det synliga vävnadsområdet och locket. Det avtagbara locket möjliggör också manipuleringar av vävnaden såväl som lokal applicering av ämnen, såsom specifika hämmare och terapier, märkning av färgämnen eller specifika celltyper av intresse.
Denna metod övervinner begränsningen av de tidigare beskrivna brösthudflikprocedurerna 4,7,8,13, som är begränsade till en avbildningssession och kan visualisera processer som förgrening av morfogenes (figur 5), homeostatisk vävnadsomsättning (figur 6) eller tumörtillväxt på cellnivå (figur 3B ). Men samtidigt tillåter R.MIW lokal manipulation av vävnaden mellan avbildningssessioner, vilket utgör en stor tillgång för R.MIW jämfört med den tidigare publicerade MIW 3,18 och alla andra bildfönster20,22. När du öppnar R.MIW är det viktigt att alltid upprätthålla aseptiska förhållanden för att förhindra infektionskälla. Möjligheten att öppna R.MIW i en aseptisk miljö gör det möjligt att optimera bildförhållandena före varje bildsession, vilket avsevärt förbättrar långsiktig visuell tillgång till vävnaden av intresse. Specifikt, i bröstkörteln, som är inbäddad i en adipocytrik stroma, är detta av stort värde. Dessutom kan det utbytbara locket unikt möjliggöra lokal administrering av terapier, olika celltyper, märkningsfärger, bildstyrd mikrodissektion eller någon annan lokal manipulation av vävnaden utan att behöva avsluta IVM-experimentet. Till exempel, för att studera tumörinitiering, kan specifika cancercellpopulationer injiceras direkt i duktalt träd eller stroma vid en bestämd IVM-tidpunkt och exakt bröstkörtelplats, så länge denna ROI är tillgänglig via R.MIW-ringen. För att studera tumörprogression kan specifika cancercellpopulationer (på en specifik plats, i en specifik mikromiljö eller med ett specifikt beteende) fotomarkeras under IVM-sessionen och därefter mikrodissekeras med hjälp av ett fluorescerande dissektionsmikroskop efter öppnandet av R.MIW. Isolerade celler kan bearbetas ytterligare för nedströmsanalyser, såsom (encells) mRNA-sekvensering. Genom att använda detta tillvägagångssätt kan man koppla in vivo-cellbeteende till molekylära uttrycksprofiler. Fördelen med lokal läkemedelsadministration som möjliggörs av R.MIW gör att vävnaden kan avbildas före och direkt efter behandlingen. Det intervall som behövs för att ta bort musen från bildlådan och därefter utföra lokal läkemedelsadministration efter att R.MIW-locket har öppnats kan utföras på några minuter, vilket möjliggör omedelbar fasfångst av snabbverkande läkemedel.
Vi visar att IVM i bröstkörteln genom R.MIW är kompatibel med många olika fluorescerande reportermusmodeller. Den fettrika miljön är utmanande att avbilda, och därför rekommenderas användning av ljusa fluoroforer. Men som visas här kan ännu mindre ljusa fluoroforer som mCFP visualiseras genom R.MIW under optimala bildförhållanden. Oundvikligen kommer fettkudden att utesluta avbildning av de djupare duktala strukturerna och begränsa avbildningen till de mer ytliga kanalerna. En översiktsbild med låg upplösning i början av varje IVM-experiment hjälper till att identifiera de duktala strukturer av intresse som är tillräckligt ytliga för högupplöst avbildning. Lokal vävnadsmanipulation, avlägsnande av bindväv eller ompositionering av fettvävnaden efter öppnande av R.MIW kan optimera IVM för specifika ROI som överlagras av fettvävnad. Detta är en viktig fördel jämfört med alla tidigare fönsterdesigner, som inte tillåter att utföra dessa manipuleringar och skulle kräva fullständigt avlägsnande av själva fönstret. Specifikt, för visualisering av inguinal lymfkörtel, rekommenderas att försiktigt ta bort den överliggande fettvävnaden, vilket minskar ljusspridning och möjliggör högupplöst avbildning. När du manipulerar vävnaden, håll alltid aseptiska tillstånd och förhindra blödning eller allvarlig skada på vävnaden, eftersom de kan påverka de processer som studeras under IVM-experimentet.
R.MIW är tillverkad av titan, ett material som vanligtvis används i klinisk praxis för att ersätta hårda vävnader som leder eller benplattor. Titan har flera fördelar jämfört med stålfönster, inklusive dess lätta och inerta karaktär21. Nyligen användes flera andra material för att generera nya bildfönstertyper, inklusive det flexibla kiselfönstret20. Till skillnad från R.MIW kräver det flexibla fönstret inga suturer för implantation och är lämpligt för nästan vilken anatomisk position som helst, särskilt när det gäller mjuka och ömtåliga vävnader. Kiselfönster har en minimal inverkan på djurens rörlighet på grund av deras lätta och deformerbara natur och kanske mer lämpade i experiment som studerar snabb vävnadsutvidgning och tillväxt20. En annan fördel jämfört med titanversionen är att kiselfönster är kompatibla med andra bildmetoder, inklusive magnetisk resonansavbildning20,27. Det är dock viktigt att komma ihåg att målen är optimerade för 0,17 mm glasöverdrag. Dessutom är bröstvävnad mottaglig för andningsrörelser, som är svåra att begränsa med det flexibla fönstret, särskilt när man använder ett inverterat mikroskop. Andningsartefakter minimeras av R.MIW-designen och fixeringen av R.MIW i bildrutans inlägg. Som ett resultat förvrängs inte bilder som förvärvats med den föreslagna R.MIW-installationen på grund av andningsartefakter. Emellertid kan mindre drifter i vävnadslokalisering inträffa, som vanligtvis är gradvisa och kan korrigeras med hjälp av programvara för rörelsekorrigering efter förvärv28. Med den ökande verktygslådan av IVM-teknik 2,20 kommer de specifika kraven för varje experiment så småningom att avgöra det bästa sättet att in vivo-visualisering av vävnaden av intresse. Olika fönsterkonstruktioner har olika fördelar och nackdelar och beroende på forskningsfrågan, den tillgängliga mikroskopiinställningen, den nödvändiga rumsliga och tidsmässiga upplösningen och den totala tidsperioden för den studerade processen måste det optimala tillvägagångssättet bestämmas.
Sammanfattningsvis underlättar R.MIW högupplöst karakterisering av celldynamiken under bröstkörtelutveckling, homeostas och sjukdom under flera dagar till veckor.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Research Foundation Flanders (PhD grant fundamental research 11L7222N till M.C.), Boehringer Ingelheim Foundation (PhD Fellowship to C.L.G.J.S), ett EMBO postdoctoral fellowship (bidrag ALTF 1035-2020 till C.L.G.J.S.) och Doctor Josef Steiner Award (till J.v.R).
0.9% NaCl | BD | 306573 | Other brands available |
10 mm round coverglass | Fisher scientific | 10696365 | Other brands available |
5-0 braided silk suturs | Ethicon | W580 | |
80% Ethanol | homemade | NA | |
Anesthesia induction box | Kentscientific | VetFlo-MSEKIT | |
Buprenorphine (Vetergesic®) | Ecuphar | NA | |
Cotton tips (sterile) | Fisher scientific | 13113743 | Other brands available |
Cyanoacrylate adhesive | Loctite | NA | Other brands available |
Eye ointment | Duratears | NA | |
Flexible butterfly needle | Greiner Bio-One | 450120 | Other brands available |
Graefe forceps (blunt) | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Heating pad | Kentscientific | RightTemp Jr. | Other brands available |
Imaging box | Custom made | NA | |
Infuse nutrient mixture | Braun | Nutriflex special 70/240 | |
Insulin syringes | BD | 324911 | Other brands available |
Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
Isoflurane vaporizer | Kentscientific | VetFlo-1231K | |
Needle holder | Fine Science Tools | 12510-14 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | semi-transparent tape |
Paper tape tesa | Tesa | NA | |
Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
Razor blades | Fisher scientific | 11904325 | Other brands available |
Silicon tubing | Solutions Elastomeres | NA | Any houseware |
Spring scissors (small) | Fine Science Tools | 15018-10 | |
Sterile PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Syringe (10 ml) | BD | 305482 | Other brands available |
Thin forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | |
Titanium lid for mammary imaging window | Custom made | NA | |
Titanium mammary imaging window | Custom made | NA | |
Wooden sticks toothpicks | Fisher scientific | NC1678836 | Other brands available |