Denne protokol beskriver et nyt brystbilledvindue med et udskifteligt låg (R.MIW). Intravital mikroskopi efter implantation af R.MIW muliggør langsgående og flerdages billeddannelse af den sunde og syge brystkirtel med en cellulær opløsning i de forskellige udviklingsstadier.
Brystkirtlens forgrenede struktur er meget dynamisk og gennemgår flere faser af vækst og ombygning efter fødslen. Intravital mikroskopi i kombination med hudklapkirurgi eller implantation af billeddannelsesvinduer er blevet brugt til at studere dynamikken i den sunde brystkirtel på forskellige udviklingsstadier. De fleste brystbilleddannelsesteknologier er begrænset til en tidsramme på timer til dage, mens størstedelen af brystkirtelombygningsprocesser forekommer i tidsrammer fra dage til uger. For at studere brystkirtel remodeling kræves metoder, der giver optisk adgang til vævet af interesse for længere tidsrammer. Her beskrives en forbedret version af titanium brystbilleddannelsesvinduet med et udskifteligt låg (R.MIW), der muliggør højopløsningsbilleddannelse af brystkirtlen med en cellulær opløsning i op til flere uger. Det er vigtigt, at R.MIW giver vævsadgang over hele varigheden af det intravitale billeddannelseseksperiment og derfor kan bruges til lokal vævsmanipulation, mærkning, lægemiddeladministration eller billedstyret mikrodissektion. Samlet set muliggør R.MIW karakterisering i høj opløsning af den cellulære dynamik under brystkirteludvikling, homeostase og sygdom.
Brystepitelet er et unikt sekretorisk organ til stede hos pattedyr, som producerer og udskiller mælk for at nære afkom. Gennem hele livet gennemgår brystkirtlen flere udviklings- og vækstrunder, som ledsages af strukturelle og funktionelle ændringer i vævet1. Afhængigt af udviklingsstadiet er de celletyper, der bidrager til vævsombygning, forskellige såvel som placeringen i duktaltræet.
Multiphoton intravital mikroskopi (IVM) tillader undersøgelse af brystcelledynamik in vivo i den oprindelige og minimalt forstyrrede indstilling 2,3,4. For at opnå visuel adgang til brystkirtlen er der offentliggjort flere midlertidige ex vivo– eller hudklapbilleddannelsesteknikker i forskellige stadier af brystkirteludvikling, herunder pubertet 4,5,6,7, voksenalder 2,8, amning 9,10,11,12 og tumordynamik 13,14 ,15. Selvom disse teknikker resulterer i høj rumligt og tidsmæssigt opløst billeddannelse af brystcelledynamik, er tidsrammen begrænset til timer, mens de fleste brystkirtelombygningsprocesser tager dage til uger. Derfor kræves metoder, der giver optisk adgang til vævet af interesse i længere tidsrammer. I årenes løb er der udviklet flere permanente billeddannelsesvinduer til brysttumorbilleddannelse 15,16,17,18, herunder et titanium brystbilleddannelsesvindue (MIW)2,3,19. Selvom det var meget nyttigt at studere brysttumorvækst, forblev visualisering af den sunde brystkirtelstruktur begrænset til et par dage. For nylig blev der udviklet et fleksibelt siliciumbilleddannelsesvindue, som muliggør visualisering af pubertets brystkirtlen over flere uger20. Brystkirtlen er imidlertid indlejret i en adipocytrig fedtpude, hvilket fører til omfattende lysspredning og som følge heraf begrænset synlighed af brystkanalstrukturerne. Derfor kræves der til enhver tid overlegne billeddannelsesbetingelser for at visualisere vævsdynamik over længere perioder i brystkirtlen. Hverken den klassiske MIW eller det fleksible siliciumvindue giver mulighed for vævsmanipulation eller optimering af fysisk vævsplacering før billeddannelse, da vinduet danner et lukket system efter operation og implantation. Som følge heraf vil optimal optisk adgang til det underliggende brystvæv sandsynligvis blive udelukket over længere perioder. I modsætning hertil giver hudklapteknikken mulighed for optimering og omplacering af vævet under billeddannelsessessionen, og en hudklap kan gentages flere gange2. Gentagne billeddannelsessessioner gennem en hudklap er dog kun mulige, når der er afsat tilstrækkelig tid (mindst 7 dage) mellem operationer for at muliggøre genopretning af huden og derfor er mest velegnet til at studere processer på længere tidsskalaer. Desuden er det tilrådeligt ikke at udføre denne procedure mange gange på grund af dens invasive karakter og stor risiko for infektioner og ardannelse ved sårlukning.
For at overvinde disse begrænsninger, dvs. for at sikre optimale billeddannelsesforhold i en længere periode ved en høj frekvens og samtidig tillade vævsmanipulation, blev en forbedret titaniumversion af MIW med et udskifteligt låg (R.MIW) designet til at visualisere den sunde og syge brystkirtel over flere dage til uge2 (figur 1A, B). R.MIW blev specialdesignet til at give optimal vævsadgang, hvilket muliggør direkte vævsmanipulation over hele IVM-eksperimentets varighed og derved muliggør visualisering af brystkirtlen på det rigtige tidspunkt og sted over længere perioder. Når den er lukket, danner R.MIW et lufttæt system, der kan sammenlignes med den klassiske MIW (figur 1C). Når R.MIW åbnes under aseptiske forhold, tillader den lokal vævsmanipulation for at forbedre optisk adgang og muliggør også lokal administration af stoffer, såsom vejhæmmere eller agonister, injektion af forskellige celletyper af interesse, såsom kræftcelle- eller immuncellepopulationer eller tilsætning af vævsmærkningsfarvestoffer. Låget kan åbnes når som helst mellem billeddannelsessessioner uden at forårsage skade på det underliggende væv.
Figur 1: Design af brystfotovinduet med udskifteligt låg. (A) Set fra oven og til siden af det udskiftelige låg på brystkassen med et 10 mm dækglas limet på ringen. (B) Set fra oven og til siden af brystbilledet, som består af en ydre ring og en indre ring med en rille imellem for at sikre vinduet i musens hud ved hjælp af en pungstrengssutur. Den ydre ring har en lille rille, der passer til lågets fire fremspring (arme). (C) Tegneserie og billeder, der viser lågets åbnings- og lukkemekanismer. De skrå projektioner sørger for, at låget er fastgjort inde i vinduesrammen. Denne figur er blevet ændret fra Messal et al. 2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Denne protokol beskriver design- og implantationsproceduren for R.MIW samt en langsgående IVM-strategi for at revidere de samme brystkanaler og deres visualisering ved en cellulær opløsning. R.MIW tillader følgende celledelinger og morfologiske ændringer under forskellige udviklingsfaser af brystkirtlen i forskellige fluorescerende reportermusmodeller. Samlet set letter R.MIW højopløsningskarakterisering af den cellulære dynamik under brystkirteludvikling, homeostase og sygdom.
R.MIW tillader langsgående billeddannelse af den sunde og syge brystkirtel i sit oprindelige og minimalt forstyrrede miljø og tillader gentagen visualisering af brystkirtlen på forskellige udviklingsstadier. R.MIW-designet gør det muligt at åbne vinduet når som helst under eksperimentet. Langsigtet visuel adgang til væv af interesse kan hindres, for eksempel ved ophobning af celleaffald på dækslippen. I sådanne tilfælde kan R.MIW åbnes før eller umiddelbart efter en billeddannelsessession for at muliggøre rengøring af hele det synlige vævsområde og låg. Det aftagelige låg tillader også manipulationer af vævet samt lokal anvendelse af stoffer, såsom specifikke hæmmere og terapier, mærkning af farvestoffer eller specifikke celletyper af interesse.
Denne metode overvinder begrænsningen af de tidligere beskrevne brysthudklapprocedurer 4,7,8,13, som er begrænset til en billeddannelsessession, og kan visualisere processer såsom forgreningsmorfogenese (figur 5), homeostatisk vævsomsætning (figur 6) eller tumorvækst på celleniveau (figur 3B ). Men samtidig tillader R.MIW lokal manipulation af vævet mellem billeddannelsessessioner, hvilket udgør et stort aktiv for R.MIW sammenlignet med den tidligere offentliggjorte MIW 3,18 og alle andre billeddannelsesvinduer 20,22. Når du åbner R.MIW, er det vigtigt at opretholde aseptiske forhold til enhver tid for at forhindre enhver infektionskilde. Evnen til at åbne R.MIW i et aseptisk miljø gør det muligt at optimere billeddannelsesbetingelserne forud for hver billeddannelsessession, hvilket i høj grad forbedrer den langsigtede visuelle adgang til vævet af interesse. Specifikt i brystkirtlen, som er indlejret i en adipocytrig stroma, er dette af stor værdi. Desuden kunne det udskiftelige låg unikt muliggøre lokal administration af terapi, forskellige celletyper, mærkningsfarvestoffer, billedstyret mikrodissering eller enhver anden lokal manipulation af vævet uden behov for at afslutte IVM-eksperimentet. For eksempel for at studere tumorinitiering kan specifikke kræftcellepopulationer injiceres direkte i det duktale træ eller stroma på et bestemt IVM-tidspunkt og præcis brystkirtelplacering, så længe denne ROI er tilgængelig via R.MIW-ringen. For at studere tumorprogression kan specifikke kræftcellepopulationer (på et bestemt sted, i et specifikt mikromiljø eller med en bestemt adfærd) fotomærkes under IVM-sessionen og derefter mikrodisseres ved hjælp af et fluorescerende dissektionsmikroskop efter åbningen af R.MIW. Isolerede celler kan behandles yderligere til downstream-analyser, såsom (enkeltcelle) mRNA-sekventering. Ved at bruge denne tilgang kunne man koble in vivo-celleadfærd til molekylære ekspressionsprofiler. Fordelen ved lokal lægemiddeladministration aktiveret af R.MIW gør det muligt at afbilde vævet før og direkte efter behandlingen. Det interval, der er nødvendigt for at fjerne musen fra billeddannelsesboksen og efterfølgende udføre lokal lægemiddeladministration efter åbning af R.MIW-låget, kan udføres på få minutter, hvilket muliggør øjeblikkelig faseindfangning af hurtigtvirkende lægemidler.
Vi viser, at IVM af brystkirtlen gennem R.MIW er kompatibel med mange forskellige fluorescerende reportermusmodeller. Det fedtrige miljø er udfordrende at image, og derfor anbefales brugen af lyse fluorophorer. Men som vist her kan endnu mindre lyse fluorophorer såsom mCFP visualiseres gennem R.MIW under optimale billeddannelsesforhold. Fedtpuden vil uundgåeligt udelukke billeddannelsen af de dybere duktale strukturer og begrænse billeddannelsen til de mere overfladiske kanaler. Et oversigtsbillede med lav opløsning i starten af hvert IVM-eksperiment hjælper med at identificere de duktale strukturer af interesse, der er tilstrækkeligt overfladiske til billeddannelse i høj opløsning. Lokal vævsmanipulation, fjernelse af bindevæv eller omplacering af fedtvævet efter åbning af R.MIW kan optimere IVM til specifikke RIE’er, der er overlejret af fedtvæv. Dette er en vigtig fordel i forhold til alle tidligere vinduesdesign, som ikke tillader at udføre disse manipulationer og ville kræve fuldstændig fjernelse af selve vinduet. Specifikt til visualisering af den inguinale lymfeknude anbefales det forsigtigt at fjerne det overliggende fedtvæv, hvilket reducerer lysspredning og muliggør billeddannelse i høj opløsning. Når du manipulerer vævet, skal du altid holde aseptiske tilstande og forhindre blødning eller alvorlig skade på vævet, da de kan påvirke de processer, der undersøges under IVM-eksperimentet.
R.MIW er lavet af titanium, et materiale, der almindeligvis anvendes i klinisk praksis til at erstatte hårdt væv såsom led eller knogleplader. Titanium har flere fordele i forhold til stålvinduer, herunder dets lette og inerte karakter21. For nylig blev flere andre materialer brugt til at generere nye billedvinduestyper, herunder det fleksible siliciumvindue20. I modsætning til R.MIW kræver det fleksible vindue ingen suturer til implantation og er velegnet til næsten enhver anatomisk position, specifikt i tilfælde af blødt og skrøbeligt væv. Siliciumvinduer har en minimal indvirkning på dyrs bevægelighed på grund af deres lette og deformerbare natur og måske mere velegnet til eksperimenter, der studerer hurtig vævsudvidelse og vækst20. En anden fordel i forhold til titaniumversionen er, at siliciumvinduer er kompatible med andre billedbehandlingsmetoder, herunder magnetisk resonansbilleddannelse20,27. Det vil dog være vigtigt at huske på, at målene er optimeret til 0,17 mm glasovertræk. Desuden er brystvæv modtageligt for vejrtrækningsbevægelser, som er svære at begrænse ved hjælp af det fleksible vindue, især når man bruger et omvendt mikroskop. Åndedrætsartefakter minimeres af R.MIW-designet og fikseringen af R.MIW i indlægget på billeddannelsesboksen. Som følge heraf forvrænges billeder, der er erhvervet ved hjælp af den foreslåede R.MIW-opsætning, ikke på grund af vejrtrækningsartefakter. Imidlertid kan der forekomme mindre drifter i vævslokalisering, som normalt er gradvise og kan korrigeres ved hjælp af bevægelseskorrektionssoftwareefter erhvervelse 28. Med den stigende værktøjskasse af IVM-teknologier 2,20 vil de specifikke krav til hvert eksperiment i sidste ende bestemme den bedste måde at in vivo-visualisering af vævet af interesse. Forskellige vinduesdesign har forskellige fordele og ulemper, og afhængigt af forskningsspørgsmålet, den tilgængelige mikroskopiopsætning, den krævede rumlige og tidsmæssige opløsning og det samlede tidsrum for den studerede proces skal den optimale tilgang bestemmes.
Sammenfattende letter R.MIW højopløsningskarakterisering af den cellulære dynamik under brystkirteludvikling, homeostase og sygdom over flere dage til uger.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Research Foundation Flanders (ph.d.-stipendium grundforskning 11L7222N til M.C.), Boehringer Ingelheim Foundation (ph.d.-stipendium til C.L.G.J.S), et EMBO postdoc-stipendium (bevilling ALTF 1035-2020 til C.L.G.J.S.) og Doctor Josef Steiner Award (til J.v.R).
0.9% NaCl | BD | 306573 | Other brands available |
10 mm round coverglass | Fisher scientific | 10696365 | Other brands available |
5-0 braided silk suturs | Ethicon | W580 | |
80% Ethanol | homemade | NA | |
Anesthesia induction box | Kentscientific | VetFlo-MSEKIT | |
Buprenorphine (Vetergesic®) | Ecuphar | NA | |
Cotton tips (sterile) | Fisher scientific | 13113743 | Other brands available |
Cyanoacrylate adhesive | Loctite | NA | Other brands available |
Eye ointment | Duratears | NA | |
Flexible butterfly needle | Greiner Bio-One | 450120 | Other brands available |
Graefe forceps (blunt) | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Heating pad | Kentscientific | RightTemp Jr. | Other brands available |
Imaging box | Custom made | NA | |
Infuse nutrient mixture | Braun | Nutriflex special 70/240 | |
Insulin syringes | BD | 324911 | Other brands available |
Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
Isoflurane vaporizer | Kentscientific | VetFlo-1231K | |
Needle holder | Fine Science Tools | 12510-14 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | semi-transparent tape |
Paper tape tesa | Tesa | NA | |
Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
Razor blades | Fisher scientific | 11904325 | Other brands available |
Silicon tubing | Solutions Elastomeres | NA | Any houseware |
Spring scissors (small) | Fine Science Tools | 15018-10 | |
Sterile PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Syringe (10 ml) | BD | 305482 | Other brands available |
Thin forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | |
Titanium lid for mammary imaging window | Custom made | NA | |
Titanium mammary imaging window | Custom made | NA | |
Wooden sticks toothpicks | Fisher scientific | NC1678836 | Other brands available |