Använda 2-fotonmikroskopi för att kvantifiera effekterna av kronisk ensidig ureteral obstruktion på glomerulära processer

Summary

Här presenterar vi ett protokoll med 2-fotonmikroskopi i München Wistar Fromter-råttor med ytglomeruli för att kvantifiera effekterna av långvarig ureteral obstruktion på glomerulär dynamik och funktion.

Abstract

Att tillämpa nya mikroskopimetoder på lämpliga djursjukdomsmodeller för att utforska njurens dynamiska fysiologi är fortfarande en utmaning. Råttor med ytglomeruli ger en unik möjlighet att undersöka fysiologiska och patofysiologiska processer med hjälp av intravital 2-fotonmikroskopi. Kvantifiering av glomerulärt kapillärblodflöde och vasokonstriktion och dilatation som svar på läkemedel, permeabilitet och inflammation är bara några av de processer som kan studeras. Dessutom ger transgena råttor, dvs podocyter märkta med fluorescerande färgämnen och andra molekylära biomarkörmetoder, ökad upplösning för att direkt övervaka och kvantifiera protein-proteininteraktioner och effekterna av specifika molekylära förändringar.

Hos möss, som saknar ytglomeruli efter fyra veckors ålder, har ensidig ureteral obstruktion (UUO) i flera veckor använts för att inducera ytglomeruli. Eftersom denna induktionsmodell inte tillåter baslinjestudier kvantifierade vi effekterna av UUO på glomerulära processer i UUO-modellen i München Wistar Frömter (MWF) råttor, som har ytglomeruli under fysiologiska förhållanden. UUO-modellen i fem veckor eller mer inducerade signifikanta förändringar av brutto njurmorfologi, den peritubulära och glomerulära mikrovaskulaturen, liksom strukturen och funktionen hos rörformiga epitel. Flödet av glomerulära och peritubulära röda blodkroppar (RBC) minskade signifikant (p < 0,01), troligen på grund av den signifikanta ökningen av vidhäftningen av vita blodkroppar (WBC) inom glomerulära och peritubulära kapillärer. Den glomerulära siktningskoefficienten för albumin ökade från 0,015 ± 0,002 i obehandlade MWF till 0,045 ± 0,05 hos 5 veckor gamla UUO MWF-råttor. Tolv veckors UUO resulterade i ytterligare ökningar av ytans glomerulära densitet och glomerulär siktningskoefficient (GSC) för albumin. Fluorescerande albumin filtrerat över glomeruli reabsorberades inte av de proximala tubulerna. Dessa data tyder på att användning av UUO för att inducera ytglomeruli begränsar förmågan att studera och tolka normala glomerulära processer och sjukdomsförändringar.

Introduction

Att förstå glomerulära processer, särskilt podocytbiologi, har varit ett mål i över 50 år. München Wistar-råttor med ytglomeruli har spelat en central roll i dessa studier, inklusive mikropunkturstudier, för att förstå många aspekter av fysiologiska och patologiska processer ^1,2,3. Användningen av mikroskopi för att studera glomerulära komponenter intravitalt var begränsad på grund av effekterna av fototoxicitet fram till tillkomsten av 2-fotonmikroskopi som minimerade denna toxiska exponering och ökade penetrationsdjupet ^1,2. Tillsammans med snabba framsteg inom datorhårdvara och programvara har detta möjliggjort tredimensionella (3D) och fyrdimensionella (tids) studier i timmar i en enda inställning ^1,4,5.

Kvantifieringen av glomerulärt kapillärblodflöde, vasokonstriktion och dilatation som svar på läkemedel, permeabilitet och effekterna av laddning på permeabilitet och inflammation är bara några av de glomerulära processer som har studerats. Dessutom är S1-segmentet av den proximala tubulen identifierbar, och skillnaderna i beteendet hos S1 och S2 rörformigt epitel kan kvantifieras ^1,4. Studier på möss, särskilt med den universella tillgängligheten av mustransgena anläggningar, har lett till snabba framsteg i förståelsen av molekylärbiologin för glomerulära sjukdomsprocesser. Enskilda proteiner är ansvariga för glomerulär dysfunktion i knockoutstudier, särskilt med avseende på proteinuri ^6,7,8. Användningen av musmodeller för glomerulära avbildningsstudier har dock varit begränsad eftersom glomeruli är mer än 100 μm under ytan i de många studerade stammarna⁹.

Detta har lett till att utredare utvecklat och använt musmodeller som resulterar i ytglomeruli som kan studeras. Den vanligaste modellen är användningen av komplett UUO^10,11,12. I slutet av den förlängda UUO-perioden finns det många ytglomeruli i möss njurar som kan och har studerats^13,14. Det har inte gjorts någon baslinje- eller kontrollstudie i dessa musstudier för att bestämma effekterna av långvarig UUO på glomerulär biologi. Eftersom detta är en allvarlig och långvarig skademodell som resulterar i snabb fibros och kortikal förstörelse^10,11,12, antog vi att det skulle finnas effekter på glomerulära processer och funktion. För att besvara denna fråga användes München Wistar Fromter (MWF) råttor med ytglomeruli för att studera kontroll-/baslinjeparametrar, och baslinjefyndet jämfördes med glomerulära studier på MWF-råttor efter fem veckors UUO. Vi studerade också Sprague Dawley (SD) råttor som inte har ytglomeruli efter UUO. Resultaten tyder på att 5 veckors UUO hos MWF- och SD-råttor verkligen ökar antalet ytglomeruli. Dessa var emellertid onormala glomeruli med markanta förändringar i glomerulärt blodflöde, inflammation och makromolekylpermeabilitet och storlek.

Protocol

Alla experiment följde guiden för vård och användning av laboratoriedjur och godkändes av djurvårds- och användningskommittén vid Indiana University School of Medicine. 1. Förbereda München Wistar Frömter eller SD-råtta för UUO-kirurgi Bedöva råttan med isofluoran (5% induktion, 1,5-2,5% underhåll), raka sedan, tvätta och desinficera det kirurgiska området flera gånger i en cirkulär rörelse med både en jodbaserad eller klorhexidinbaserad skrubba och alkohol. Applicera långverkande / långsam frisättning smärtstillande medel för smärtlindring enligt de institutionella IACUC-riktlinjerna. Gör ett snitt längs mittlinjen med en skalpell; Leta reda på den vänstra njuren och frigör den från de omgivande peritoneala organen. Lokalisera försiktigt njurpedikeln, som består av njurartären, njurvenen och urinledaren. Separera urinledaren från de andra strukturerna, vidta försiktighetsåtgärder för att inte skada den känsliga strukturen. Använd fina pincett, slinga försiktigt en 3-0 sutur runt urinledaren och binda av den, var försiktig så att du inte river den. Upprepa denna procedur några millimeter på vardera sidan av den första knuten för att knyta en andra knut och säkerställa fullständig obstruktion. När proceduren är klar, stäng försiktigt de successiva muskelskikten. Innan du stänger det sista lagret, tillsätt 2 ml varm, steril 0,9% saltlösning i buken innan du stänger det helt. Stäng den yttre huden med kirurgiska häftklamrar. Applicera långverkande / långsam frisättning smärtstillande medel för smärtlindring och observera återhämtning noggrant enligt de institutionella IACUC-riktlinjerna. Övervaka därefter regelbundet och förbered dig för avbildning i slutet av den femte veckan. 2. Syntes av Texas Red råtta serumalbumin (TR-RSA) Väg upp 100 mg råttserumalbumin och lös upp det i 6,67 ml 0,1 m natriumbikarbonatbuffert vid pH 8,4 i ett 50 ml koniskt rör. Till en injektionsflaska med 5 mg Texas Red-X-succinimidylester, tillsätt 100 μL dimetylformamid (DMF, hög kvalitet) och virvel tills allt färgämne är upplöst. Placera råttserumalbuminlösningen på en virvel med låg/medelhög inställning, så att lösningsvolymen snurrar långt under toppen av det öppna röret. Tillsätt det upplösta färgämnet medan röret virvlas. Ta det koniska röret på 50 ml, linda det i folie, placera röret på valfri vippa eller rulle och rör om långsamt i 1 timme vid rumstemperatur (RT). I en 5 L hink med 0,9% NaCl med en omrörningsstång under försiktig omrörning, våt membranen i en lämplig 50 kDa molekylviktsavskuren dialysator (ett membran med klämmor, slutna membranrör eller dialyskassetter är alla lämpliga). Ladda TR-RSA-lösningen i membransystemet och fäst den på flotationsfästena som vanligtvis ingår i systemet. Placera 5 L-behållaren med 0,9% saltlösning/TR-RSA över natten vid 4 °C (i ett kallrum) med försiktig omrörning på en omrörningsplatta. Byt dialyslösningen minst tre gånger under de närmaste 36 timmarna. Svullnad av membranet ökar volymen av den nu klara TR-RSA-lösningen. Dela de ursprungliga 100 mg med volymen för att få en ungefärlig koncentration: färgämnet: proteinförhållandet blir 1:1. Alikvotera i lämpliga volymer och frystorkas för långvarig lagring. 3. Förberedelse för 2-foton intravital avbildning på ett inverterat mikroskop Ta bort locket på en 50 mm täckskiva bottenplatta (med 40 mm täckglasdiameter) och placera 8 stycken autoklavtejp på den inre botten bredvid kanten. Gör ett pyramidformat, tomt fönster med 4 stycken per sida för att låta den yttre njuren passa snyggt i detta utrymme samtidigt som kontakten med autoklavtejpen bibehålls, vilket hjälper till att minimera rörelse. Justera avståndet efter råttans storlek för att säkerställa bästa kontakt med njuren. Placera 1 termisk dyna på varje sida av 50 mm täckglasets bottenskål. Se till att värmedynan täcker scenen. Använd ett 40x vattenfördjupningsmål vid 0,75x zoom och 1,5x zoom för att generera 30x respektive 60x bilder, vilket möjliggör bilder med lägre och högre förstoring. Tillsätt vid behov vatten till målet med en 1 ml spruta med en lång bit PE-200-slang som kan nå toppen av målet i en nedåtgående vinkel för att förhindra att vattendroppen transporteras ner i slangen. Använd 2% laseröverförbarhet, med blå, gröna och röda detektorer inställda på förutbestämda nivåer för att säkerställa konsistens i bilderna mellan studierna. Ställ in excitationsvåglängden till 800 nm på den refererade lasern (se materialtabellen), som effektivt kommer att excitera alla fluoroforer som används i denna studie.Använd externa (icke-avkalkade) detektorer för att samla in blå utsläpp med hjälp av ett fotomultiplikatorrör (PMT) (420-490 nm, få 950). Använd en Hyd-detektor för att fånga upp gröna utsläpp (500-550 nm, få 100). Använd en Hyd-detektor för att fånga upp röda utsläpp (590-660 nm, få 200). Justera förskjutningen i PMT (blå emissioner) så att endast några pixlar i de tomma vävnadsområdena har ett värde på noll.OBS: HyD-detektorerna för de gröna och röda utsläppen har automatisk kompensationsjustering; endast vinsten kan ställas in. Ställ in bitdjupet på 12-bitars för att ge bilderna en skala med 4 096 intensitet mellan svart och vitt.OBS: Det är nödvändigt att ställa in de nedre gränserna för detektorerna (offset i PMT) för att inte utesluta dessa värden för att säkerställa insamling av lågintensiva utsläpp inom Bowmans utrymme. Om känslighetsinställningen är för låg indikerar de visuella varningsmarkörerna detta; Dessa värden ges ett intensitetsvärde på noll. Späd cirka 6 mg Texas-Red-X-Rat serumalbumin till en total volym på 1 ml, ladda lösningen i en 1 ml spruta och placera den inre i.v-katetern i steg 4.1 efter infusion av Hoechst 33342 i steg 9.1. 4. Kirurgisk förberedelse för intravital 2-fotonavbildning Placera den förbedövade råttan med en inre venös åtkomstlinje (lårben eller hals) på sidan med den rakade vänstra flanken uppåt platt och rakt på bordet. Se till att de främre tassarna rör varandra, liksom de bakre tassarna. Palpera försiktigt den vänstra flanken strax under revbenen för att känna för njuren för att bestämma den naturliga positionen i buken. Om det behövs, rita en linje med en permanent markör längs det rakade området och skär njurcentret i en näsa-till-svans-orientering. Använd ett par tandade pincett, ta tag i huden och lyft den uppåt för att underlätta klämning av den permanenta markörlinjen med ett par hemostater för att krossa den underliggande vaskulaturen och förhindra blödning när du gör snittet med en kirurgisk sax. Upprepa detta för det tunna yttre muskelskiktet för att minimera blödning. För att göra det slutliga snittet av det tunna inre magmuskelskiktet, repalpera njuren för att uppskatta storleken och positionen. Lyft försiktigt det inre muskelskiktet med ett par pincett och krossa en linje som skär huden ovanför njuren med hemostaterna som är ungefär 1/3rd den uppskattade storleken på njuren. Behåll greppet på muskelskiktet med pincetten, gör det sista snittet.OBS: Det är bättre att göra ett mindre snitt och expandera efter behov än att göra det för stort, vilket kräver partiell stängning med en sutur. Greppa försiktigt njuren av det omgivande fettet. Använd båda händerna med tång i varje hand, arbeta för att greppa fettet vid njurens nedre pol genom att använda en hand-över-hand-teknik för att greppa och hålla njurfettet och arbeta nedåt. Ha ett fast grepp om fettet vid njurens nedre pol med en hand, dra försiktigt fettet och, om det behövs, pressa försiktigt njuren genom snittet. Om njuren inte passerar lätt, bredda snittet. 5. Positionering av råttan för avbildning Placera försiktigt den exponerade njuren mot skålens kant, med en liten rotation så att njurens buksida kommer i kontakt med täckglaset och ryggsidan är vänd bort från kanten. För att ytterligare minimera rörelsen, ta två sterila 2 x 2 gasbindor, fukta dem med saltlösning och packa dem mot njurens dorsala sida, vilket förstärker kontakten på njurens buksida till kanten. Titta igenom mikroskopets okular under epifluorescensbelysning med hjälp av en dubbelpass Rhodamin / FITC-kub. Om rörelse upptäcks, gör mindre justeringar av positionen och justera försiktigt gasbindningen, se till att den inte trycker under njurarna. För att ytterligare minska rörelsen, rulla råttan något, så att bröstkorgen är längre bort från skålen. 6. Bildförvärv för kvantitativ analys Skanna njurens yta med epifluorescensbelysning (steg 5.3) och markera glomerulipositionerna med hjälp av programvaran som är associerad med den motoriserade stegkontrollen (en funktion i moderna system). För varje färgkanal under 2-fotonbelysning, ta en grund 3D-volym av den övre delen av varje markerad glomerulus, som kommer att fungera som bakgrundsbilder. Använd en pseudofärgpalett i visningsalternativet för bildprogramvaran för att bättre visualisera de svaga intensiteterna i bakgrundsfluorescensen hos de glomerulära kapillärslingorna. Med hjälp av ett ytligt blodkärl som kontaktpunkt, infusera långsamt det fluorescerande albuminet, vilket ger tid att observera uppkomsten och fallet av fluorescens på grund av systemisk distribution. Infusera tillräckligt med TR-RSA för att uppnå en intensitet i peritubulär vaskulatur och kapillärslingor som ligger strax under mättnad.OBS: Det finns vanligtvis en fördröjning på 5 s mellan infusionen av material och dess utseende i blodomloppet när njurperfusion är normal. Vänta cirka 10 minuter innan du får 3D-volymer (1 μm-intervall) för alla markerade och avbildade glomeruli från steg 6.2.OBS: Simonsens München Wistar-råttor har färre ytglomeruli. Men eftersom Frömterstammen av MW-råttor har ett större antal ytglomeruli, kan upp till 10 glomeruli ofta avbildas. Avliva råttan via en överdos av isofluran i slutet av studien. Utför en dubbel pneumotoracotamy för att säkerställa eutanasi. 7. Beräkning av glomerulär permeabilitet Använd bildvisningsprogramvaran som är associerad med mikroskopsystemet och exportera bilderna till 12-bitars råbilder för bearbetning och analys. Ladda 3D-bakgrundsvolymerna och den råa 3D-volymen som innehåller det cirkulerande fluorescerande albuminet. Lokalisera fokalplanet i 3D-volymen med den ljusaste ytliga kapillärslingan i glomeruli med tillräckligt med utrymme till kanten av den omgivande Bowmans kapsel. Använd visuella landmärken och leta reda på samma fokusplan som finns i bakgrundsvolymen. Välj en region i kapillärslingan och en inom Bowmans utrymme som noterar de genomsnittliga intensitetsvärdena för var och en. Använd dessa intensitetsvärden som bakgrundsvärden. Skissera ett område (minst 20 x 20 pixlar i området) inom Bowmans utrymme i den albumininnehållande bilden och notera intensitetsavläsningen (välj ett område som inte ligger intill en kapillärslinga eller Bowmans kapsel för att säkerställa den renaste mätningen av Bowmans rymdintensiteter). Flytta den ritade regionen över två andra regioner för att ta ett medelvärde för den genomsnittliga intensiteten inom Bowman’s Space. Välj den ljusaste plasmafluorescerande intensiteten inom kapillärslingsektionen och cirkla runt denna region. Använd tröskelfunktionen för att markera de ljusa värdena (vanligtvis placerade vid kanterna på kapillärslingväggarna), undvik cirkulerande RBC-skuggor och registrera värdet.OBS: Eftersom faktorer i blodet kommer att orsaka en underskattning av plasmafluorescensnivåerna är det viktigt att välja de ljusaste områdena. Ange värdena i ett kalkylblad för att beräkna generalsekretariatet med hjälp av Eq (1):Generalsekretariatet = (1) 8. Beräkning av flödet av röda blodkroppar i ytan glomerulära kapillärslingor och njurkärl med hjälp av en linjekan fungera Hitta ett lämpligt kärl (antingen en kapillärslinga eller ett peritubulärt kärl). Eftersom linescan-funktionen i den refererade bildförvärvsprogramvaran (se materialförteckningen) kräver att kärlet är vinkelrätt, rotera bilden med rotationsfunktionen . När fartyget har roterats och ligger plant väljer du XT-funktionen på förvärvsmenyn . Ställ in för att skanna 4 000 rader. Placera linan över fartyget som ska undersökas. Se till att fokalplanet har den maximala diametern på det segment som ska avbildas. Vänsterklicka på den sammansatta färgbilden och välj Ta ögonblicksbild för att skapa en referensbild av området där linjeburken togs. Klicka omedelbart på Start för att fånga fartygets linjeburk. För att bestämma RBC-flödeshastigheten, importera linescans till bildbehandlingsprogrammet (se materialförteckningen). Öppna dialogrutan Visa regionstatistik under rullgardinsmenyn Mått . Välj ritverktyget för en rad och rita en linje som matchar lutningen på RBC-skuggorna. Notera bredd- och höjdvärdena.OBS: Pixelvärdena som erhålls för bredd kommer att motsvara avståndet; pixlarna för höjd motsvarar tiden. Använd följande formel (Eq (2)) för att beräkna hastigheten.RBC-flöde i μm/s = (2)OBS: Detta motsvarar inhämtningsparametrar vid 60x förstoring och en skanningshastighet på 400 Hz med det refererade mikroskopet (se materialförteckningen).Gör minst fem beräkningar och beräkna medelvärdet för dem för att rapportera hastigheten för varje linje.OBS: Dessa parametrar kommer att vara beroende av pixeldimensionen och förvärvshastigheten för mikroskopsystemet. 9. Beräkning av WBC-ocklusion i glomerulära kapillärslingor Administrera Hoechst 33342 kärnfläck (vid ~ 8 μg / kg råttvikt) via en inre venös åtkomstledning för att identifiera WBC som sitter i kapillärslingorna.OBS: Det användbara djupet kommer att begränsas på grund av fotonspridning och absorption av hemoglobin, särskilt för kortare våglängdsblå utsläpp. Centrera en glomerulus i bildfältet och ta en 3D-datauppsättning som börjar vid den glomerulära ytan och avsluta data minst 30 till 35 μm. Använd en stegstorlek på 1 μm i Z-riktningen. Identifiera WBC: er genom att jämföra den blå Hoechst-kanalen med Texas Red albumin-kanalen; leta efter uteslutning av rött färgämne i kapillärslingan och en motsvarande kärnfläck för att positivt identifiera WBC: erna. Definiera vita blodkroppar som “vidhäftade” om de verkar statiska över 3 optiska sektioner. Rapportera värdena som förekomst/10 optiska sektioner från toppen av glomerulus, tagna med 1 μm intervall. 10. Poängsättning av närvaron av Rouleaux-formationer i ytglomeruli Följ samma anvisningar för steg 9.3 och hämta en 3D-datauppsättning. Leta efter Rouleaux-formationer som visas som RBC: er staplade i paket som motstår dissociation när de rör sig längs kapillärslingorna. Använd en röd fluorofor för bättre visualisering av struktur på större djup på grund av mindre fotonspridning för de längre våglängdsröda utsläppen. Rapportera värdena som förekomst/25 optiska sektioner från toppen av glomerulus, tagna med 1 μm intervall. 11. Isolering av glomeruli Isolera tre grupper av glomeruli från färska njurar med hjälp av en standardsiktningsteknik som resulterar i nära 90% renhet av råtta glomeruli15.Placera njurbarken i kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och hacka den med flera fina saxar eller rakblad. Tillsätt den finhackade vävnaden i en 100 μm steril cellsil och tryck försiktigt igenom den med en 5 ml sprutkolv och 50-100 ml kall PBS.OBS: De flesta tubulerna behålls medan glomeruli passerar igenom. Placera den berikade glomerulifraktionen på ett 70 μm filter och tvätta dem i stor utsträckning med kall PBS. Tvätta filtret med 100-200 ml kall PBS för att ta bort de flesta av de återstående tubulerna. Samla glomeruli från filtret med 1-2 ml kall PBS, centrifug (10 000 × g, 2 min, 4 ° C) och snäppfrys dem i flytande kväve tills RNA-isolering.OBS: Glomerulär renhet bestämd med faskontrastmikroskopi är >90%, och utbytet är cirka 10 mg från 2 njurar. 12. Glomerulär RNA-isolering Homogenisera den frysta glomerulipelleten med hjälp av RNA-isoleringsreagenset genom att tillsätta 400 μL av reagenset och bryta upp pelleten med en 200 μL pipettspets, följt av kort virvel och 5 minuters inkubation vid RT16. Tillsätt 40 μl 1-brom-3-klorpropan (BCP), virvel i 15 s och håll vid RT i 15 minuter. Centrifugera vid 12 000 × g, 15 min, 4 °C. Ta bort det vattenhaltiga skiktet, späd det nedre lagret med en lika stor volym på 70% etanol och ladda det direkt på en spinnkolonn (se materialförteckningen). Efter tvätten, var och en bestående av tillsats av respektive lösning till kolonnen följt av centrifugering vid 12 000 x g, 15 s, 26 °C [3 totalt, första 2 med 500 μL RPE (proprietär mild tvättbuffert med etanol för att avlägsna spår av salter, 3:e tvätt med 500 μL 80 % EtOH], eluera RNA genom tillsats av 15 μLH2 O och centrifugera, som för tvättarna. Kontrollera koncentrationen och renheten hos RNA och transportera RNA-proverna till kärnanläggningen för nanostränganalys17,18.OBS: Totalt RNA-utbyte är ungefär 1-2 μg. Här innehöll de 24 proverna 200 ng RNA vid 30 ng/μl. 13. Nanostring analys OBS: Nanostring-tekniken är baserad på digital detektion och direkt molekylär streckkodning av målmolekyler som använder färgkodade sondpar. Capture-sonden bär en biotindel på 3′-änden, och Reporter-sonden bär signalen på sin 5′-ände. Skicka nanostring-gensondparen och CodeSets till Michigan State’s Genomic Core Facility och använd enligt anvisningar från NanoString.Det finns sex positioner för färgkoderna, och varje position kan vara en av fyra färger, vilket möjliggör en stor mångfald av taggar som var och en kan lösas individuellt och identifieras under datainsamlingen. Hämta data som samlats in av Genomic Core-anläggningspersonalen med hjälp av den egenutvecklade Nanostring nCounter Digital-analysatorn, som samlar in synfält med hjälp av ett mikroskopmål och CCD-kamera och tabellerar och visar streckkodsräkningarna. Importera rådata till Nanostrings nSolver-programvara för analys. Normalisera data som normaliserats med hjälp av standardinställningarna och jämför data mellan grupper enligt beskrivningen i deras manual.OBS: Målet var att övervaka genförändringar som tidigare visat sig vara förändrade i kortikal vävnad från en UUO modell19, njursjukdom 17,20,21,22,23,24,25,26. Totalt 126 gener, inklusive de rekommenderade positiva och negativa kontrollerna, analyserades i varje glomeruligrupp (CONT, SHAM, & UUO).

Representative Results

Tre grupper av glomeruli isolerades med hjälp av en standardsiktningsteknik som resulterar i nära 90% renhet av råtta glomeruli15. Den första glomeruligruppen var från vänster njure av SD-råttor som genomgick en vänster njure urinledarklämma i 5 veckor, UUO (5 män, 3 honor). Den andra glomeruligruppen isolerades från den kontralaterala kontrollnjuren från samma råtta, CONT (5 män, 3 honor). Den tredje gruppen glomeruli isolerades från SD-råttor som genomgick SHAM-kirurgi, och den vänstra njuren användes för glomeruliisolering efter 5 veckor, SHAM (4 män, 4 honor). Morfologiska förändringarExternalisering av den blockerade njuren för avbildning avslöjade en grovt förstorad njure, ungefär fyra gånger den normala storleken, med tunt epitel synligt genom det vätskefyllda njurinteriören. Genom ett 20x-mål, med hjälp av epifluorescensbelysning och en FITC / Rhodamine dual-pass cube, var den mest uppenbara förändringen gallringen av det rörformiga epitelet och den enhetliga kollapsen av rörformiga lumen längs hela rörlängden. Histologin har beskrivits väl och är svår vid en vecka av UUO10,11,12. Antalet glomeruli som är synliga vid ytan hos MWF- och SD-råttor ökade efter fem veckors ensidig urinledarobstruktion. Bild 1A visar den metod som används för att skapa UUO-modellen. Den högra njuren är orörd och ger en tillräcklig glomerulär filtreringshastighet för råttan. Antalet glomeruli per fält med ett 20x mål (363 μm x 363 μm) räknades och visades i en graf i figur 1B. Antalet ytglomeruli hos MWF-råttor ökade från 1,08 ± 0,11/fält hos obehandlade råttor till 2,97 ± 0,65/fält i femveckors UUO-gruppen. SD-råttor gick från att inte ha någon ytglomeruli till 2,02 ± 0,37/fält efter 5 veckors UUO. Intravitala 2-fotonbilder togs av dessa råttor efter injektion med TR-RSA (röd), en 10 kDa Cascade Blue dextran (10 kDa-CB) och Hoechst 33342 för att märka kärnorna (cyan). Dessa visas för normala MWF-råttor (figur 1C), MWF-råttor efter fem veckors UUO (figur 1D) och SD-råttor efter fem veckors UUO (figur 1E). Dessa bilder belyser dramatiska förändringar som uppstår i den rörformiga epitelen. Proximala tubulelysosomer, som normalt är små punkterade orangefärgade ansamlingar hos obehandlade MWF- och SD-råttor, blir stora singulära vakuolära strukturer som fyller majoriteten av den krympta rörformiga cellen. Som beskrivs av TR-RSA-albuminet verkade vaskulaturen rätad ut och i många kärl, utan flytande RBC, som endast visar strömmande plasma. Fixering av njurarna avslöjade att cortex hade tunnats ut till en fibrös hud som inte var tjockare än en millimeter. Dessa observationer överensstämmer med tidig litteratur med hjälp av denna modell 3,10,11,12. Förändringar i renal vaskulär dynamik och glomerulär permeabilitetNjurblodflödet minskade signifikant i både femveckors UUO MWF- och SD-grupperna jämfört med obehandlade råttor (figur 2). Sham-opererade MWF-råttor hade ett peritubulärt RBC-flöde på 885 ± 25 μm/s. Peritubulärt RBC-flöde hos fem veckors UUO MWF- och SD-råttor minskade till 250 ± 100 μm/s respektive 200 ± 125 μm/s. Dessa värden beräknades genom att samla linjeskanningar över peritubulära kärl för att beräkna RBC-hastighet. Figur 2D visar ett diagram över dessa data. RBC-hastigheten inom de glomerulära kapillärslingorna minskade signifikant hos de fem veckors UUO MWF- och SD-råttorna jämfört med obehandlad MWF (figur 3). I många fall visade sig glomeruli ha kapillärslingor helt utan flytande RBC: er. Kapillärslinga RBC-flödeshastigheter var 1 405 ± 425 μm / s, 250 ± 220 μm / s ± och 190 ± 200 μm / s eller obehandlad MWF, fem veckors UUO MWF respektive fem veckors UUO SD-råttor (Figur 3D). Inom kapillärslingorna i de fem veckors UUO-grupperna avslöjade RBC: s tröga flöde närvaron av vidhäftande WBC: er, antingen saktar flödet eller blockerar det, med endast plasmaflöde visualiserat nedströms från den partiella eller totala obstruktionen. För att kvantifiera denna observation räknades antalet vidhäftande WBC: er som hittades i en 3D-volym och normaliserades sedan till förekomst per varje 10 μm 3D-volymdjup. Strukturen hos den vidhäftade vita cellen kunde urskiljas med hjälp av cyankärnfärgämnets fluorescens från Hoechst 33342. Tyvärr begränsade den större fotonspridningen av blåemitterande lampor tillförlitlig identifiering av WBC genom deras kärnor till de övre 10 optiska sektionerna från toppen, tagna vid 1 μm steg av glomerulär volym. Obehandlade MWF-råttor hade mindre än 0,125 ± 0,05 WBC/ 10 optiska sektioner uppifrån, tagna vid 1 μm stegvolym medan detta antal ökade till 1,5 ± 0,5 och 3,25 ± 0,7 hos 5-veckors UUO MWF respektive 5-veckors UUO SD-råttor (figur 3E). En annan vaskulär förändring som också kan stå för minskat RBC-flöde i 5-veckors UUO-grupperna var det regelbundna utseendet på Rouleaux-formationer (grupperade RBC: er som följs i en “staplad mynt” -konfiguration, se infällning av figur 3F). Rouleaux-formationer flyter långsammare och kan stoppas av en vidhäftande WBC. Obehandlade WMF-råttor har praktiskt taget inga Rouleaux-formationer i sina glomerulära kapillärer, med endast 0,05 ± 0,05 förekomster per 25 optiska sektioner från toppen, tagna vid 1 μm steg . De fem veckors UUO MWF- och SD-råttorna hade en markant ökning av Rouleaux-formationerna 2,27 ± 0,46 och 1,46 ± 0,73 per 25 optiska sektioner från toppen, tagna vid 1 μm steg respektive (figur 3F). Förutom minskningen av glomerulära RBC-flödeshastigheter som ses med UU sågs en ökning av albuminpermeabiliteten. Det fanns större heterogenitet i albuminpermeabilitet mellan glomeruli. Ibland var albuminackumuleringen inom Bowman’s Space tillräckligt intensiv för att tydligt kunna ses (figur 4B, asterisk). Den glomerulära siktningskoefficienten för albumin ökade från 0,015 ± 0,002 i obehandlade MWF, till 0,045 ± 0,05 i 5-veckors UUO MWF och 0,052 ± 0,075 hos fem veckors UUO SD-råttor. Förändrad proximal tubulfunktionIntressant nog kunde det filtrerade albuminet inte detekteras i proximala tubulceller efter UUO. S1-segmentet endocytoser normalt stora mängder albumin27,28,29,30, vilket visas här under fysiologiska förhållanden hos obehandlade MWF-råttor (figur 5A). Samma upptag kunde inte ses i MWF eller SD PT efter 5 veckors UUO (figur 5B,C). Proximala tubuli som omger glomeruli avbildade mellan 45 och 60 min efter TR-RSA-infusion poängsattes för antingen närvaro (1) eller frånvaro (0) av albumin. Det är viktigt att notera att under fysiologiska förhållanden binder och internaliserar S1-segmentet ivrigt albumin med lite eller inget albumin som når de distala tubulerna eller uppsamlingskanalerna. Därför är det självklart att de senare proximala tubulärsegmenten inte får innehålla albumin, vilket resulterar i en bråkdelspositivitet för albuminupptag på mindre än 1,0. Figur 5D visar ett diagram med resultaten från poängsättning av proximalt tubuläralbuminupptag. Obehandlad MWF hade ett proximalt tubulärfraktionerat upptagsvärde på 0,556 ± 0,126. Både femveckors UUO MWF- och SD-råttor hade signifikant lägre värden på 0,049 ± 0,126 respektive 0,00 ±0,00. Studier slutfördes också på 12-veckors UUO MWF-råttor (tabell 1). Tolv veckors UUO är den standardtid som används för musstudier för att inducera ytglomeruli. Tre UUO-hanråttor avbildades och glomerulär densitet ökade ytterligare till 6,16 ± 1,83 glomeruli per 20x fält hos dessa råttor. RBC-flödeshastigheten var 293 ± 67 μm/s, WBC-vidhäftningen var 1,47 ± 1,12, båda liknar 5-veckors UUO-data. Generalsekretariatet för albumin ökade också jämfört med 5-veckors UUO-råttor till 0,109 ± 0,04. Glomerulära mRNA-förändringar inducerade av kronisk UUOTabell 2 visar alla gener (sonder) med deras grupperade uttryck och standardavvikelsevärden. Observera att gener valdes ut för analys baserat på tidigare dokumentation av förändring i njursjukdom, inklusive UUO som beskrivs i protokollavsnitt 13: s anteckning. Figur 6 är en värmekarta över data som belyser de dramatiska förändringarna i genuttryck för de flesta gener i UUO-glomeruli jämfört med antingen kontroll eller skenglomeruli. Figur 1: Ökning av antalet ytglomeruli och induktion av ytglomeruli hos SD-råttor efter 5-veckors UUO hos MWF-råttor. (A) Ett kirurgiskt diagram över urinledaren på vänster njure som försiktigt frigörs från njurartären och venen innan den täpps till med två band med kirurgisk sutur. (B) Ett diagram som visar ökningen av antalet ytglomeruli hos MWF-råttor före och fem veckor efter UUO tillsammans med antalet ytglomeruli hos SD-råttor, som normalt inte har några ytglomeruli. Antalet ytglomeruli hos MWF-råttor ökade från 1,08 ± 0,11/fält hos obehandlade råttor till 2,97 ± 0,65/fält i 5-veckors UUO-gruppen. SD-råttor gick från att inte ha någon ytglomeruli till 2,02 ± 0,37/fält. Tredimensionella rekonstruerade bilder visar njurytan för obehandlad MWF (C), MWF efter 5-veckors UUO (D) och SD efter fem veckors UUO (E). Observera utseendet på stora, orange vakuolära strukturer som har samlats från små enskilda lysosomer till stora onormala kroppar. 5-veckors UUO hos SD-råttor resulterade inte i områden som liknade normal tubulär epitel som ses i C och delvis i D. Kärlen verkade rätad ut i vissa regioner och hade i många partiella ocklusioner som tillät plasma men inte RBC att flöda. (n =3 hanråttor per grupp) Skalstänger = 40 μm. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Förkortningar: UUO = ensidig ureteral obstruktion; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; G = glomerulus; RBC = röda blodkroppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2: Minskning av RBC-flödet i den ytliga peritubulära kärlen efter 5-veckors UUO. Linecans samlades in i peritubulära blodkärl för att bestämma RBC-flödeshastigheten i μm / s. Kortfattat representerar de röda referenslinjerna som visas i A, B och C ett litet område där samma pixelbreda område skannades upprepade gånger och bilderna staplades i en kolumn för att visualisera förvrängningen orsakad av de flytande RBC: erna, som färdas snabbare än mikroskopet kan förvärva dem. Kolumnen intill referensfiguren är linescan, där lutningen på RBC-distorsionen används för att beräkna hastighet (x-axel = avstånd och y-axel = tid). Här motsvarar gradvis brantare sluttningar långsammare RBC-hastigheter eftersom de förblir längre i linjeområdet. Observera skillnaden i utseendet på RBC: erna hos obehandlade MWF-råttor (A) jämfört med fem veckors UUO-bilder för MWF (B) och SD (C) råttor. RBC-flödeshastigheterna för de tre råttgrupperna visas i D. Peritubulärt RBC-flöde i obehandlade MWF var i genomsnitt 885 ± μm/s. Dessa värden sjönk betydligt fem veckor efter UUO hos MWF- och SD-råttor till 250 ± 100 μm/s respektive 200 ± 125 μm/s. Skalstreck = 20 μm, n = 3 hanråttor per grupp. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Förkortningar: UUO = ensidig ureteral obstruktion; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; RBC = röda blodkroppar; WBC = vita blodkroppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3: Signifikant minskning av RBC-flöde med glomerulär kapillärslinga och inducerad aktivering av WBC-vidhäftning med 5-veckors UUO. Samma linjekanmetod som används för att bestämma peritubulärt RBC-flöde användes för att undersöka förändringar i glomerulärt kapillärblodflöde. Panelerna A, B och C visar en liknande layout som figur 2 och fokuserar på en glomerulus i skendriven MWF, fem veckors UUO MWF respektive fem veckors UUO SD. (D) En graf som visar den fysiologiskt höga RBC-flödeshastigheten i kapillärslingorna från skenopererade MWF-råttor i genomsnitt 1 405 ± 425 μm/s ± 425, minskade till 250 ± 220 μm/s och 190 ± 200 μm/s för 5-veckors UUO MWF respektive 5-veckors UUO SD-råttor. Vid undersökning av de glomerulära kapillärslingorna var vidhäftande WBC lätt synliga medan de fokuserade genom glomerulus. Tredimensionella optiska sektioner av enskilda glomeruli togs, och de första 10 optiska sektionerna, 1 μm från varandra, användes för att mäta antalet vidhäftande WBC: er. Obehandlade MWF-råttor hade praktiskt taget inga synliga WBC i sina volymer, i genomsnitt mindre än 0,125 ± 0,05 WBC / 10 optiska sektioner från toppen, tagna vid 1 μm steg. I 5-veckors UUO MWF- och SD-råttor ökade dessa siffror till 1,5 ± 0,5 och 3,25 ± 0,7 WBC/10 optiska sektioner uppifrån, tagna vid 1 μm steg, respektive. Dessa resultat visas i diagrammet i panel E, med färginsatser som visar WBC: er som täcker kapillärslingor. Rouleaux-formationer (pilar, infällda i panel F) visas som RBC: er tätt bundna i en “staplad mynt” -konfiguration som till stor del behåller sin buntade gruppering även i turbulensen av blodflödet. Dessa patologiska strukturer var lätta att urskilja på större djup inom glomerulus. Skendrivna MWF-råttor saknade i stort sett dessa strukturer och hade endast 0,05 ± 0,05 förekomster 25 optiska sektioner från toppen, tagna vid 1 μm steg glomerulär volym. Däremot hade 5-veckors UUO hos både MWF- och SD-råttor en markant ökning av Rouleaux-formationer med förekomster av 2,27± 0,46 respektive 1,46 ± 0,73/25 optiska sektioner från toppen, tagna vid 1 μm steg. Skalstreck= 20 μm, n = 3 hanråttor per grupp. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Förkortningar: UUO = ensidig ureteral obstruktion; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; RBC = röda blodkroppar; WBC = vita blodkroppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 4: Signifikant ökning av glomerulär kapilläralbuminpermeabilitet efter 5-veckors UUO. Panelerna A, B och C visar pseudofärgbilder av en 3D-volym för råttserumalbuminkanal i obehandlade MWF-, 5-veckors UUO MWF respektive fem veckors UUO SD-råttor. Bilderna presenteras i en pseudocolor-palett för att markera den märkbara mängden filtrerat albumin som ses i Bowmans utrymme, särskilt i panel B (asterisk). (A) Bowmans utrymme (asterisk) visar den normala nivån av albumin som vanligtvis ses hos obehandlade MWF-råttor, oskiljbara för ögat. Bilder av glomeruli togs före infusionen av albumin för att subtrahera bakgrundsfluorescensvärden från de som tagits efter administrering av albumin. (D) Ett diagram med den glomerulära siktningskoefficienten för albumin hos obehandlade MWF-råttor, med ett värde av 0,015 ± 0,002. Detta värde ökade avsevärt till 0,045± 0,05 hos 5-veckors UUO MWF-råttor och 0,052 ± 0,075 hos femveckors UUO SD-råttor. Denna parameter är ett kvotvärde för fluorescerande intensiteter i Bowmans rymd dividerat med plasmavärdet och har ingen associerad måttenhet. Skalstreck = 20 μm, n = 3 hanråttor per grupp. Pseudocolor intensitetsskala ligger under panel D. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Förkortningar: UUO = ensidig ureteral obstruktion; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; RBC = röda blodkroppar; WBC = vita blodkroppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 5: Nedsatt funktion i proximala tubuli efter 5-veckors UUO. (A) En bild av en ytlig glomerulus och S1-segmentet från en normal München Wistar Frömter-råtta tagen 40 minuter efter infusion av TR-RSA och Cascade Blue dextran. Internalisering av TR-RSA kan ses i S1-segmentet och den proximala tubulen. I skarp kontrast visar MWF-råttor (B) och SD-råttor (C), som utsätts för 5-veckors UUO, allvarligt förändrade proximala tubuler med minimalt eller inget upptag av TR-RSA. De normalt små, punkterade autofluorescerande lysosomerna (A) blir stora och vakuolära gulorange strukturer, ofta med en fullständig kollaps av det rörformiga lumenet, som inte kan hittas i de tredimensionella datamängderna. (C) Distala tubuler som normalt saknar någon form av autofluorescens innehåller nu autofluorescerande ansamlingar. Att poängsätta de proximala tubuli som omger glomeruli i liknande bilder tagna 45-60 min efter infusion, för albuminupptag, visade en signifikant skillnad mellan den skendrivna MWF-gruppen och båda 5-veckors UUO-grupperna. Obehandlade MWF-råttor hade ett proximalt tubulärfraktionerat upptagsvärde på 0,556 ± 0,126. Både femveckors UUO MWF- och SD-råttor hade signifikant lägre värden på 0,049 ± 0,126 respektive 0,00 ±0,00. Skala bar = 20 μm, n = 3 hanråttor per grupp. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Förkortningar: UUO = ensidig ureteral obstruktion; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; RBC = röda blodkroppar; WBC = vita blodkroppar; TR-RSA = Texas Röd råtta serumalbumin. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 6: Genuttrycksförändringar med UUO . (A) En värmekarta över data. (B) Normaliserade genförändringar för alla data i ett spridningsdiagram. Uttryck av gener i kontrollnjurarna plottades från lågt till högt uttryck, och generna från både SHAM- och UUO-njurarna jämfördes med kontrolluttrycksnivåerna. Gendatapunkter som faller nära kontrollgenernas diagonala värde indikerar liknande uttrycksnivåer för båda grupperna, medan datapunkter över eller under diagonalen indikerar högre respektive lägre uttrycksnivåer. Observera att SHAM-generna kluster närmare kontrolldiagonaluttrycket än UUO-generna, som är mer variabla. Förkortning: UUO = ensidig ureteral obstruktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Tabell 1: Progression av skada från 5 till 12 veckors UUO. Jämförelse av 5- och 12-veckors UUO-avbildningsparametrar hos tre manliga MWF-råttor och tre SD-hanråttor vid varje tidpunkt. Femveckorsdata är desamma som i tidigare siffror. Observera ökningen av glomerulär densitet och generalsekretariatet för albumin med fortsatt UUO. Förkortningar: UUO = ensidig ureteral obstruktion; SD = Sprague-Dawley; MWF = München Wistar Frömter; GSC = glomerulär siktningskoefficient. Klicka här för att ladda ner den här tabellen. Tabell 2: Analys av inflammationsmarkörer hos glomeruli från UUO och kontrollråttor. Gensondpar och CodeSets designades och användes enligt anvisningar från NanoString. Över 100 gener analyserades, plus positiva och negativa kontroller som specificeras av Nanostring. Alla gener (sonder) med deras grupperade uttryck och SD-värden visas i tabellen. Figur 6A är en värmekarta över data, medan figur 6B presenterar genförändringarna för alla data i ett spridningsdiagram. Observera likheterna mellan kontroller och SHAM och distinkta förändringar för de flesta gener i UUO. Förkortningar: UUO = ensidig ureteral obstruktion; SD = standardavvikelse. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Discussion

Studien av glomerulär fysiologi har sett många olika tillvägagångssätt, framför allt användningen av mikropunktur, perfusion av isolerade glomeruli och mikroskopi. Tillgången på ytglomeruli hos München Wistar-råttor, Fromter- och Simonsen-stammar, har möjliggjort dynamiska in vivo-studier . En viktig anmärkning för utredare som använder denna teknik är behovet av att ställa in förvärvsparametrar för att upprätthålla konsekventa bilder mellan studier, så att autofluorescensen i vävnad förblir konsekvent. Genom att använda en dubbelpassfluorescein / rhodaminepifluorescenskub och justera förstärkningsinställningarna till de gröna och röda emissionskanalerna för att efterlikna på datorskärmen vad som ses genom okularen kommer att säkerställa en konsekvent färgsignatur i autofluorescensen även mellan olika mikroskopsystem.

Fromter-stammen har använts i stor utsträckning eftersom den har ett minskat antal totala glomeruli, ~ 75% normala, och männen utvecklar spontant högt blodtryck vid cirka 12 veckors ålder, med progressiv proteinuri och efterföljande fokal glomerulär skleros, så småningom dör av njursvikt¹². Användningen av dessa råttor och tillsatsen av 2-fotonmikroskopi med dess reducerade fototoxicitet, förbättrade penetrationsdjup och förmågan att se flera fluorescerande sonder samtidigt banade väg för nya upptäckter ^1,4,5. Med utvecklingen av datorhårdvara och programvara är kvantitativa data nu standarden för alla 2-fotonlaboratorier. Flera kvantitativa tekniker har utvecklats och tillämpats på glomerulära, proximala tubulära, vaskulära och interstitiella processer under fysiologiska och sjukdomsförhållanden 1,4,5,27,28,29,30.

Transgena musgenererande anläggningar tillförde en ny dimension till studien av njurfysiologi och patologi, och det var bara en tidsfråga tills detta kombinerades med 2-fotonmikroskopi för att ytterligare avgränsa betydelsen av specifika genprodukter i njurstruktur och funktion. Musglomeruli, utom hos mycket unga möss, ligger emellertid över 100 μm från njurens yta⁹. Tvåfotonmikroskopi utförs bäst på ett djup av mellan 20 och 50 μm som upplösning, och fluorescensintensiteten minskar snabbt därefter på grund av ljusspridning av utemitterat ljus och absorption från interaktion med hemoglobin. Därför var det nödvändigt att inducera ytglomeruli. Det tillvägagångssätt som vanligtvis används är en långvarig ensidig obstruktionsmodell i 12 veckor. Eftersom dessa modeller inte tillåter baslinjebestämningar är det inte möjligt att separera effekterna av UUO från den process som studeras.

Med hjälp av MWF-råttor kan man jämföra baslinjens glomerulära funktion med den följande UUO. Denna UUO-modell är känd för att inducera inflammation och en snabb frekvens av fibros och har använts för att studera CKD och fibros^10,11,12. Som förväntat var det en ökning av ytglomeruli hos både MWF- och SD-råttorna. Dessutom var de kvantitativa resultat som erhölls efter UUO för MWF- och SD-råttor mycket jämförbara. Minskningen av blodflödet som registrerats här hade tidigare rapporterats jämföra mikroskopiska data efter UUO med mikropunkturdata³. Det var också välkänt att tubulär och interstitiell histologi är markant förändrad, och PT: erna är mestadels icke-funktionella, som rapporterats här, med brist på albuminendocytos. Studierna i figur 2 och figur 3 visar en dramatisk minskning av RBC-flödeshastigheten i glomerulära och peritubulära kapillärer och förbättrad WBC-vidhäftning. Minskningarna i flödet beror sannolikt på kapillärblockering från WBC-vidhäftning och rouleauxformationer.

För att ytterligare utvärdera inflammation kvantifierade vi albuminpermeabiliteten och visade att den ökade tiofaldigt. Dessutom visade isolerade glomeruli att mRNA-uttrycket ökade för många gener som tidigare var kända för att öka vid njurinflammation i en mängd olika njursjukdomstillstånd 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Ökningarna i glomerulär ytdensitet och albuminpermeabilitet var progressiva, vilket framgår av 12-veckors UUO-data. De nuvarande uppgifterna är de första som direkt visar att glomeruli genomgår betydande strukturella skador, inflammation och molekylära förändringar i UUO-modellen. Resultaten överensstämmer med en tidigare studie av hel njurvävnad som analyserade fårnjurebiopsier efter UU och fann flera inflammationsmarkörer förhöjda¹⁹. De nuvarande resultaten indikerar att markant inflammation finns inom glomeruli, tidigare endast känd för kortikal vävnad.

Nuvarande data skiljer sig från tidigare studier på möss där inga förändringar hittades i vidhäftningsmolekyluttryck, komplementavsättning och neutrofil infiltration mellan 12-veckors posthydronefrotisk och normal glomeruli³¹. Dessutom använde Hickey-laboratoriet 12-veckors UUO-modellen för att studera immunreaktioner hos glomeruli hos möss. De fann inga skillnader i neutrofil infiltration mellan fyra veckor gammal musglomeruli och postobstruktiv glomeruli^32,33. Dessa senare studier genomfördes efter att bäckenet i den blockerade njuren dränerades på urin. Vi gjorde inte detta eftersom vi ville bestämma effekten av UUO på glomerulär funktion som det skulle vara in vivo, utan att artificiellt avlägsna vätskan som orsakar hindret. Slutligen ersätts användningen av UUO hos möss med avbildning av glomeruli vid mer än 100 μm under ytan. Även om det är möjligt finns det en avvägning av upplösning och intensitet, båda reduceras avsevärt när en går utöver 50 μm³⁴.

De resultat som presenteras är inte förvånande om man pusslar ihop data från den befintliga litteraturen om histologiska förändringar, bildning av atubulär glomeruli, inflammation, fibros, hemodynamik^10,11,12. De data som presenteras, inklusive WBC-vidhäftning, rouleauxformationer, glomerulära molekylära inflammationsmarkörer och ökad albuminpermeabilitet, indikerar ytterligare den omfattande inflammation som pågår i denna UUO-modell även vid fem veckor och som också finns vid tolv veckor. Det är uppenbart att kronisk UUO inte är ett fysiologiskt tillstånd, och användningen av UUO för att inducera ytglomeruli representerar en skademodell. MWF-råttorna, som har ytglomeruli under fysiologiska förhållanden, kan studeras longitudinellt när skada uppstår. Det är möjligt att generera transgena råttor, och många utredare skapar dem med biosensorer för att ställa specifika frågor. I synnerhet har Medical College of Wisconsin nu en koloni av MWF-råttor och har gjort transgena råttor i syfte att studera glomerulära processer under fysiologiska och patologiska förhållanden. Dessa MWF-råttor erbjuder ett utmärkt tillfälle att studera glomerulära processer hos normala, sjuka och genetiskt förändrade råttor.

Materials

70 µm sterile cell strainer	Corning	#421751
100 µm sterile cell strainer	Corning	#421752
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Electric heating pad	Sunbeam	Kroger
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat#72930
Leica Dive SP-8 Multi-Photon Inverted Microscope	Leica Microsystems	Note: Version 7.1r1
MaiTai DeepSee titanium-sapphire laser	Spectra-Physics	NA
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics	Cat# 78266-04
Microsoft Excel	Microsoft Corportation	2007 version
Quant-iT RNA Assay Kit	Invitrogen/ThermoFisher	Q33140
Reptitherm Undertank Heater	Zoomed	Amazon
RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns)	Qiagen	74204
RPE buffer	Qiagen	1018013
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
TRI Reagent	Sigma	T9424
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07