Isolamento das Mitocôndrias do Músculo Esquelético do Rato para Ensaios Respirométricos
Summary
Aqui, descrevemos um método detalhado para o isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético do camundongo e a análise subsequente da respiração pela Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) usando assins respirométricos à base de microplacas. Este gasoduto pode ser aplicado para estudar os efeitos de múltiplas intervenções ambientais ou genéticas no metabolismo mitocondrial.
Abstract
A maior parte da energia da célula é obtida através da degradação da glicose, ácidos graxos e aminoácidos por diferentes vias que convergem para o sistema de fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS), que é regulado em resposta às demandas celulares. A molécula lipídica Coenzyme Q (CoQ) é essencial nesse processo, transferindo elétrons para o complexo III na cadeia de transporte de elétrons (ETC) através de ciclos constantes de oxidação/redução. O estado mitocôndria e, em última análise, a saúde celular podem ser avaliadas medindo o consumo de oxigênio etc usando assistos respirométricos. Esses estudos são tipicamente realizados em linhas celulares estabelecidas ou primárias que foram cultivadas por vários dias. Em ambos os casos, os parâmetros de respiração obtidos podem ter se desviado de condições fisiológicas normais em qualquer determinado órgão ou tecido.
Além disso, as características intrínsecas das fibras únicas cultivadas isoladas do músculo esquelético impedem esse tipo de análise. Este artigo apresenta um protocolo atualizado e detalhado para a análise da respiração em mitocôndrias recém-isoladas do músculo esquelético do camundongo. Também fornecemos soluções para possíveis problemas que possam surgir em qualquer etapa do processo. O método aqui apresentado poderia ser aplicado para comparar as taxas de consumo de oxigênio em diversos modelos de camundongos transgênicos e estudar a resposta mitocondrial a tratamentos medicamentosos ou outros fatores como envelhecimento ou sexo. Este é um método viável para responder a perguntas cruciais sobre metabolismo e regulação bioenergetics mitocondrial.
Introduction
Mitocôndrias são as organelas metabólicas primárias na célula1. Essas organelas especializadas em membrana usam moléculas de nutrientes para produzir energia na forma de triphosfato de adenosina (ATP) por OXPHOS. Este processo se baseia na transferência de elétrons de moléculas de doadores em uma série de reações redox no ETC2. CoQ é o único lipídio ativo de redox que é endogenosamente produzido em todas as membranas celulares e lipoproteínas circulantes que mostra função antioxidante3. É um componente essencial do ETC, transferindo elétrons do complexo I e fadh2 dependentes de NADH II para o complexo III, embora muitas outras reductases possam conduzir a redução do CoQ mitocondrial para o ubiquinol como um passo obrigatório em múltiplas vias metabólicas celulares4,5.
Ao longo do processo, um gradiente de prótons eletroquímicos é criado através da membrana interna mitocondrial, que é transformada em energia biologicamente ativa pelo complexo de sintetizador ATP V2. Consequentemente, a disfunção mitocondrial leva a uma miríade de condições patológicas que afetam principalmente tecidos com necessidades de alta energia – o cérebro, o coração e o músculo esquelético6,7. Por isso, é fundamental desenvolver métodos para analisar com precisão os bioenergésicos mitocondriais para investigar seu papel na saúde e na doença, particularmente em tecidos altamente energéticos, como os músculos esqueléticos.
O eletrodo de oxigênio do tipo Clark tem sido usado clássicamente no estudo da respiração mitocondrial8. No entanto, este sistema tem sido progressivamente deslocado por tecnologias de maior resolução, com tecnologias de consumo de oxigênio baseadas em microplaca, como os analisadores XF Agilent Seahorse sendo especialmente populares9. No campo muscular esquelético, esses estudos são tipicamente conduzidos em células cultivadas, principalmente na linha de células mioblast do camundongo imortalizada C2C12 ou culturas primárias derivadas de células satélite10,11. No entanto, esses estudos não recapitulam totalmente a situação in vivo, especialmente quando se investigam a biologia mitocondrial e funcionam no nível tecidual sobre insultos específicos, intervenções nãogenéticas ou manipulações genéticas.
Além disso, os ensaios de respiração nas células são mais complexos devido a fatores adicionais, incluindo a demanda extra-mitocondrial de ATP e ensaios substratos ou eventos de sinalização, o que poderia enganar a interpretação dos resultados. Alternativamente, também é possível usar pacotes únicos ou de miofibers recém-isolados dos músculos. No entanto, o método de isolamento é tecnicamente desafiador e só é viável para alguns tipos musculares. Neste caso, os músculos flexor digitorum brevis (FDB) e extensor digitorum longus (EDL) são usados principalmente10,12,13, embora alguns relatórios descrevam o uso de outros tipos musculares também14,15.
O perfil bioenergésico das seções musculares esqueléticas também foi relatado16. A maior vantagem deste método é que músculos intactos podem ser estudados (os autores mostram que o corte através de fibras não perturba os resultados quando comparado com miofibers isolados). No entanto, o acesso mitocondrial a substratos e inibidores de ensaios é limitado e, portanto, apenas alguns parâmetros podem ser medidos16. Por fim, mitocôndrias isoladas também podem ser empregadas9,17,18,19. Neste caso, mitocôndrias perdem seu ambiente citosolico, o que pode afetar sua função. Em contraste, este método garante o acesso a substratos e inibidores, permite a análise de uma infinidade de tipos de amostragem e normalmente requer menos material.
Este artigo descreve um método para realizar o perfil bioenergéstico de mitocôndrias isoladas do músculo esquelético do rato usando assins respirométricos à base de microplacas (Figura 1). Em particular, três protocolos são detalhados: o Ensaio de Acoplamento, CA para avaliar o grau de acoplamento entre o ETC e o maquinário OXPHOS; o Ensaio de Fluxo de Elétrons, EFA para medir a atividade dos complexos etc individuais; e o ensaio BOX para determinar a capacidade mitocondrial de β-oxidação. Notavelmente, apenas pequenas quantidades de amostras são necessárias em comparação com métodos convencionais de respirometria. O protocolo de isolamento utilizado aqui foi modificado a partir do método publicado em outros lugares18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Todos os métodos utilizados para estudar a respiração mitocondrial têm suas limitações; portanto, é crucial selecionar o método que melhor se adequa a uma questão experimental específica. Este trabalho fornece um protocolo atualizado e detalhado para isolar mitocôndrias do músculo esquelético do rato para realizar diferentes ensaios respiratórios para investigar a função mitocondrial. De fato, o estudo de bioenergésicos mitocondriais mitocôndicos em mitocôndrias isoladas usando tecnologias baseadas em …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Juan J. Tena pelo uso do homogeneizador e das instalações de Proteomia e Pecuária CABD para suporte técnico. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Educação, Cultura e Esportes espanhol através da bolsa FPU16/03264 a J.D.H.C., a Associação Française contre les Myopathies (AFM) através do bolsa de estudos nº 22450 à C.V.-G., uma Subvenção Institucional MDM-2016-0687 (Unidade de Excelência Maria de Maeztu, Departamento de Regulação Genética e Morfogênese na CABD) e BFU2017-83150-P para J.J.C. A Junta de Andalucía concede P18-RT-4572, o Programa de Financiamento feder da União Europeia, e o Ministério da Ciência, Inovação e Universidades espanholas concede RED2018-102576-T à P.N.
Materials
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
Referências
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