호흡 측정을 위한 마우스 골격근으로부터 미토콘드리아의 분리
Summary
여기에서는 마우스 골격근으로부터의 미토콘드리아를 분리하는 상세한 방법과 마이크로플레이트 기반 호흡 측정법을 사용하여 산소 소모율(OCR)에 의한 호흡의 후속 분석을 설명한다. 이 파이프 라인은 미토콘드리아 대사에 대한 여러 환경 또는 유전 적 개입의 효과를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.
Abstract
대부분의 세포 에너지는 세포 요구에 반응하여 조절되는 미토콘드리아 산화 인산화 (OXPHOS) 시스템에 수렴하는 다양한 경로에 의해 포도당, 지방산 및 아미노산의 분해를 통해 얻어집니다. 지질 분자 코엔자임 Q (CoQ)는 일정한 산화 / 환원 사이클을 통해 전자 수송 사슬 (ETC)의 복합체 III로 전자를 전달함으로써이 과정에서 필수적입니다. 미토콘드리아 상태 및 궁극적으로, 세포 건강은 호흡 측정법을 사용하여 ETC 산소 소비를 측정함으로써 평가될 수 있다. 이들 연구는 전형적으로 수일 동안 배양된 확립된 또는 일차 세포주에서 수행된다. 두 경우 모두에서, 수득된 호흡 파라미터는 임의의 주어진 기관 또는 조직에서 정상적인 생리학적 조건으로부터 벗어났을 수 있다.
추가적으로, 골격근으로부터 분리된 배양된 단일 섬유의 본질적인 특성은 이러한 유형의 분석을 방해한다. 이 논문은 마우스 골격근에서 갓 분리 된 미토콘드리아에서 호흡 분석을위한 업데이트되고 상세한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 프로세스의 모든 단계에서 발생할 수있는 잠재적 인 문제에 대한 솔루션을 제공합니다. 여기에 제시된 방법은 다양한 트랜스제닉 마우스 모델의 산소 소모율을 비교하고 약물 치료 또는 노화 또는 성별과 같은 다른 요인에 대한 미토콘드리아 반응을 연구하는 데 적용될 수 있습니다. 이것은 미토콘드리아 생물 에너지 대사 및 조절에 관한 중요한 질문에 응답하는 실현 가능한 방법입니다.
Introduction
미토콘드리아는 세포의 주요 대사 소기관입니다1. 이 특수 막 밀폐 된 소기관은 영양 분자를 사용하여 OXPHOS에 의한 아데노신 삼인산염 (ATP) 형태로 에너지를 생산합니다. 이 과정은 ETC2에서 일련의 산화 환원 반응에서 공여체 분자로부터의 전자의 전달에 의존합니다. CoQ는 항산화 기능을 나타내는 모든 세포막과 순환 지단백질에서 내인성으로 생산되는 유일한 산화환원 활성 지질입니다3. 그것은 ETC의 필수 구성 요소이며, NADH 의존성 복합체 I 및 FADH2 의존성 복합체 II에서 복합체 III로 전자를 전달하지만, 많은 다른 환원 효소는 여러 세포 대사 경로의 필수 단계로서 미토콘드리아 CoQ를 유비퀴놀로 환원시킬 수 있습니다4,5.
이 과정 전반에 걸쳐, 전기화학적 양성자 구배가 미토콘드리아 내막을 가로질러 생성되며, 이는 ATP 신타제 복합체 V2에 의해 생물학적 활성 에너지로 변환된다. 결과적으로, 미토콘드리아 기능 장애는 주로 높은 에너지 요구 사항, 즉 뇌, 심장 및 골격근에 영향을 미치는 무수한 병리학 적 상태로 이어집니다6,7. 따라서 미토콘드리아 생물 에너지를 정확하게 분석하여 건강과 질병, 특히 골격근과 같은 에너지가 높은 조직에서 그 역할을 조사하는 방법을 개발하는 것이 기본입니다.
클락형 산소전극은 미토콘드리아 호흡8의 연구에 고전적으로 사용되어 왔다. 그러나 이 시스템은 고분해능 기술로 점차 대체되어 왔으며, 애질런트 시호스 XF 분석기와 같은 마이크로플레이트 기반 산소 소비 기술이 특히 인기가 높습니다9. 골격근 분야에서, 이러한 연구는 전형적으로 배양된 세포, 주로 C2C12 불멸화 마우스 근원세포 세포주 또는 위성 세포로부터 유래된 일차 배양물10,11에서 수행된다. 그러나, 이들 연구는 특히 미토콘드리아 생물학을 조사할 때, 특히 특정 모욕, 비유전학적 개입 또는 유전자 조작에 대한 조직 수준에서 기능하는 상황을 완전히 재검토하지 않는다.
또한, 세포의 호흡 분석은 ATP의 미토콘드리아 외 수요 및 분석 기질 또는 신호 전달 사건을 포함한 추가 요인으로 인해 더 복잡하며, 이는 결과의 해석을 오도 할 수 있습니다. 대안적으로, 근육으로부터 갓 분리된 근섬유의 단일 또는 다발을 사용하는 것도 가능하다. 그러나 격리 방법은 기술적으로 도전적이며 몇 가지 근육 유형에서만 가능합니다. 이 경우, 굴곡근 디지토럼 브레비스 (FDB)와 신근 디지토럼 롱 어스 (EDL) 근육이 주로 사용되지만10,12,13, 몇 가지 보고서는 다른 근육 유형의 사용을 설명하지만14,15.
골격근 절편의 생체에너지 프로파일링도 보고되었다16. 이 방법의 가장 큰 장점은 손상되지 않은 근육을 연구 할 수 있다는 것입니다 (저자는 섬유를 통한 슬라이싱이 분리 된 근섬유와 비교할 때 결과를 방해하지 않는다는 것을 보여줍니다). 그러나, 기질 및 분석 억제제에 대한 미토콘드리아 접근은 제한되고, 따라서, 단지 몇 가지 파라미터만이 측정될 수 있다16. 마지막으로, 분리된 미토콘드리아도 마찬가지로 채용될 수 있다9,17,18,19. 이 경우 미토콘드리아는 세포 질 환경을 잃어 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 대조적으로,이 방법은 기질 및 억제제에 대한 접근을 보장하고, 많은 샘플 유형의 분석을 가능하게하며, 일반적으로 더 적은 물질을 필요로합니다.
이 논문에서는 마이크로플레이트 기반 호흡 측정 분석을 사용하여 마우스 골격근으로부터 분리된 미토콘드리아의 생체에너지 프로파일링을 수행하는 방법을 설명합니다(그림 1). 특히, 세 가지 프로토콜이 상세하다: ETC와 OXPHOS 기계류 사이의 결합 정도를 평가하는 커플링 어세이, CA; 전자 유동 분석법, 개별 ETC 복합체의 활성을 측정하는 EFA; 및 미토콘드리아 β산화능을 결정하기 위한 BOX 분석법을 포함한다. 특히, 기존의 호흡 측정 방법과 비교하여 소량의 샘플 만 필요합니다. 여기에 사용된 격리 프로토콜은 다른 곳에 공개된 방법18에서 수정되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
미토콘드리아 호흡을 연구하는 데 사용되는 모든 방법에는 한계가 있습니다. 따라서 특정 실험 질문에 가장 적합한 방법을 선택하는 것이 중요합니다. 이 연구는 미토콘드리아 기능을 조사하기 위해 다양한 호흡 분석을 수행하기 위해 마우스 골격근에서 미토콘드리아를 분리하는 업데이트되고 상세한 프로토콜을 제공합니다. 실제로, 마이크로플레이트 기반 기술을 사용하여 분리된 미토콘드리?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 후안 J. 테나 (Juan J. Tena)에게 균질 기와 CABD Proteomics 및 축산 시설을 기술 지원으로 사용해 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작업은 스페인 교육, 문화 및 스포츠부에서 FPU16/03264 – J.D.H..C., 협회 Française contre les Myopathies (AFM)를 통해 C.V.-G.에 대한 펠로우십 보조금 #22450, 기관 보조금 MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, CABD의 유전자 규제 및 Morphogenesis 부서) 및 BFU2017-83150-P를 J.J.C에 지원했습니다. Junta de Andalucía 보조금 P18-RT-4572, 유럽 연합의 FEDER 자금 지원 프로그램 및 스페인 과학, 혁신 및 대학부는 RED2018-102576-T를 P.N.에 부여합니다.
Materials
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
Referências
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