Hücre kalsiyum görüntüleme, benzersiz fonksiyonel imzalar veren kalsiyum geçirgen kanalların / reseptörlerin ekspresyonuna dayanarak, bireysel hücrelerin, kültürdeki karışık popülasyonların ve hatta uyanmış hayvanların dinamik sinyalizasyonunu incelemek için çok yönlü bir metodolojidir.
Burada, kalsiyum kaymaları açısından dinamik olarak incelenen glia (astrositler, oligodendrositler ve mikroglia) ve / veya periferik (dorsal kök ganglionları) ve merkezi dokulardan (korteks, subventriküler zon, organoid) nöronlara dayanan devrelerin seçici in vitro modelleri hakkında rapor verdik. Sonuçları göstermek için seçilen model, karmaşık hücresel etkileşimlere sahip basit bir doku olan retinadır. Kalsiyum, önemli hücresel rollerin çoğunda yer alan evrensel bir habercidir. Kültürdeki retinal nöron-glial hücrelerin kalsiyum kaymalarını öngörerek nasıl hazırlanabileceğini ve değerlendirilebileceğini adım adım bir protokolle açıklıyoruz. Bu modelde, nöronları KCl ve ATP’ye seçici tepkilerine dayanarak glia’dan ayırıyoruz. Kalsiyum geçirgen reseptörleri ve kanalları seçici olarak farklı bölmelerde eksprese edilir. Kalsiyum yanıtlarını analiz etmek için, Fura-2 gibi oranmetrik floresan kalıpları kullanıyoruz. Bu prob, Ca2 + serbest ve Ca2 + ‘ya bağlı formlara dayanarak serbest Ca2 + konsantrasyonunu ölçer ve iki dalga boyunda algılanan floresan yoğunluğuna dayanan iki farklı tepe noktası sunar.
Kalsiyumun ikinci bir haberci olarak evrensel özellikleri nedeniyle, bu iyon çok sayıda sinyal aktivitesinde rol oynar: gen transkripsiyonu, doğum ve ölüm, çoğalma, göç ve farklılaşma, sinaptik iletim ve plastisite. Bu nedenle, kalsiyum aktivasyon dinamiklerini sadakat ve çeviklikle izleyebilen bir yöntem, benzersiz mekansal-zamansal tepkileri gözlemlemenin bir yolunu sağlayacaktır. Böyle bir yöntem, kalsiyum kaymalarını fonksiyonel verileri, farklı yanıtlarına göre spesifik hücre fenotipleriyle ilişkilendiren hücresel kalsiyum görüntüleme tekniğidir.
Ca2+ probları ilk olarak 1980’lerde geliştirildi ve daha sonraki iyileştirmeler bu moleküllerin canlı hücre tahlillerinde kullanılmasına izin verdi1. Kimyasal bir gösterge olarak, Fura-2 kantitatif [Ca2+]i ölçümleri için standart olarak kabul edilir. Bu göstergenin asetoksimetil (AM) esteri (yani, Fura-2 AM) hücre zarına kolayca nüfuz eder ve inkübasyon seyreltmesinden 20 kat daha büyük hücre içi konsantrasyonlara ulaşabilir (örneğin, [5 μM]o / [100 μM]i). Fura-2’nin bir diğer avantajı, iyi fotobeyazlatma direncine sahip olmasıdır; Bu nedenle, bu göstergenin daha uzun süre görüntülenmesi, floresan yeteneklerini büyük ölçüde etkilemeyecektir. Son olarak, Fura-2, ~ 100 nM’den ~ 100 μM’ye kadar çok çeşitli kalsiyum seviyelerine duyarlıdır ve dinlenme [Ca2 +] i2 ile karşılaştırılabilir olan ~ 145 nM’lik bir Kd’ye sahiptir. Daha sonra, boya yüklemesinden etkilenmeyen oranmetrik problarla birlikte daha iyi floresan mikroskoplar ve hesaplama yöntemleri ile hücre kalsiyum görüntüleme geliştirilmiştir.
Her hücre, nihai cevaba belirli bir imza olarak katkıda bulunan farklı kalsiyum cihazlarını (pompalar, taşıyıcılar, reseptörler ve kanallar) ifade eder. Önemli ipucu, fenotipik ifadeleriyle ilişkili farklı hücre tiplerinin seçici yanıtlarını bulmaktır. Buna göre, kalsiyum kaymaları yoluyla çalışan en az iki farklı reseptör vardır: Ca2 + ‘ya hızlı modda nüfuz eden iyonotropik reseptörler ve sinyal yolaklarına ve inositol trifosfat ve siklik ADP-riboz3 gibi ikinci haberciler tarafından aktive edilen Ca2 + ‘yı serbest bırakan hücre içi stoklara bağlı yavaş metabotropik reseptörler.
Örneğin, progenitör hücreler olgunlaşmamış retinada nestin eksprese eder ve GABA (veya mussimol) tarafından depolarize edilen GABAA reseptörlerini gösterir4. Bu, yüksek hücre içi Cl− seviyelerine sahip Cl-elektrokimyasal gradyanı nedeniyle olur; Doku geliştikçe, KCC2 taşıyıcıları progenitörler üzerinde uyarılmadan olgun GABAerjik nöronlar üzerinde inhibisyona geçer5. Öte yandan, doğum sonrası kemirgenlerin olgunlaşmamış subventriküler bölgesinde (SVZ) sox-2 eksprese eden kök hücreler de yavaş bir şekilde Ca2 + ‘yı artıran histamin tarafından aktive edilen metabotropik H1 reseptörleri sunar6. Proteaz ile aktive edilmiş reseptör-1 (PAR-1) ailesinden ikinci bir metabotropik reseptör, trombin ve aşağı akış tarafından G (q / 11) ve fosfolipaz C’ye (PLC) aktive edilir, multipotent SVZ nöral kök hücrelerinden üretilen oligodendrositlerde (O4 ve PLP’yi eksprese eden) yavaş Ca2 + kaymaları verir7.
Genel olarak, nöronlar voltaja bağımlı kalsiyum kanallarının yanı sıra glutamaterjik (AMPA, NMDA, kainat) ve periferik ve merkezi nikotinik reseptörler olarak Ca2 + ‘ya geçirgen olan majör nörotransmitter reseptörlerini eksprese eder. Potasyum klorür genellikle subventriküler bölge9 veya retina10’dan itibaren dorsal kök ganglion nöronları8 veya merkezi nöronlar olarak periferik nöronları aktive etmek için depolarizan bir ajan olarak kullanılır. Öte yandan, ATP, seçici Ca2 + geçirgen P2X üyelerini P2X7 ve P2X4 olarak aktive eden ana gliotransmitter (D-serine ek olarak) olarak kabul edilmektedir. Her iki reseptör de, vericiler tarafından aktive edilen en büyük Ca2+ akımları olarak kabul edilen NMDA reseptörleri tarafından gösterilenlere benzer şekilde eşdeğer Ca2+ akımları sunar11. P2X7 reseptörleri mikroglia üzerinde yüksek oranda eksprese edilir, ancak astrositler ve oligodendrositler üzerinde daha düşük bir yoğunlukta, proinflamatuar sitokinlerin salınımında rol oynar12. P2X7 reseptörleri ayrıca retinadaki Schwann hücreleri13 ve Müller glia üzerinde de eksprese edilir14,15.
Retinanın beyinde görülen hemen hemen tüm vericileri gösterdiği bilinmektedir. Örneğin, dikey eksen (fotoreseptörler, bipolar ve retinal ganglion hücreleri) esas olarak glutamaterjiktir, kalsiyum geçirgen AMPA veya kainat reseptörleri OFF-bipolar hücrelerde eksprese edilir ve mgluR6 ON-bipolar hücrelerde eksprese edilir16. İlginçtir ki, her üç reseptör de kalsiyum ve inositol trifosfat yolaklarına bağlı olan Müller glia’da da bulunur17,18. Yatay ve amakrin hücreler tarafından yapılan yatay inhibitör eksen, sadece GABA’yı değil, aynı zamanda dopamin, asetilkolin ve diğer klasik nörotransmiterleri de salgılar. Amakrin hücreler, kuş retina kültürlerinde bulunan ve glutamaterjik, pürinerjik, nikotinik ve voltaja bağımlı kalsiyum kanalları gibi çeşitli kalsiyum ile çalışan kanallar gösteren ana hücre tipleridir. Bu nedenle, bu, nöronlar ve glia arasındaki kalsiyum kaymalarının farklı özelliklerini değerlendirmek için mükemmel bir modeldir.
Bu nedenle, gelişim sırasında seçici fenotipik belirteçlere özetlenen farklı reseptörlerin ve kanalların farklı agonist yanıt paternleri ile kombinasyonu, seçici sinyal cihazları aracılığıyla çalışan gövde, progenit, nöron, astrosit, oligodendrosit ve mikroglia’da benzersiz imzalara izin verir.
Retina dokusunu, KCl veya ATP’nin aracılık ettiği kalsiyum yanıtlarının sırasıyla nöronal ve glial yanıtlara açıkça bölümlere ayrıldığını göstermek için kullandık (Şekil 1). Literatürdeki bazı veriler, P2X7 reseptörlerinin nöronal aktiviteyi ve sinaptik nörotransmitter salınımını20 düzenleyen nöronlarda eksprese edildiğini ima etse de, diğer yazarlar nöronal P2X7 reseptörlerinin varlığını sorgulamaktadır. Gerçekten de, mevc…
The authors have nothing to disclose.
Hibeler, sponsorlar ve finansman kaynakları: MH, doktora CNPq bursu sahibidir. HRF, CNPq tarafından desteklenen bir doktora sonrası burs alıcısıdır (HRF hibe numarası 152071/2020-2). RAMR, CNPq ve FAPERJ (hibe numaraları E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 ve 312157/2016-9 ve INCT-INNT (Ulusal Translasyonel Sinirbilim Enstitüsü) tarafından desteklenmektedir.
15 mm coverslip | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111550 | Cell suport |
510 nm long-pass filter | Carl Zeiss | ||
ATP | Sigma | A1852 | |
B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Suplement |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
CoolSNAP digital camera | Roper Scientific, Trenton, NJ | ||
D-(+)-Glucose | Neon | 1466 | |
DMEM/ F-12 | Gibco | 12400-24 | Cell culture medium |
Excel Software | Microsoft | ||
Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Suplement |
Fluorescence Microscope | Axiovert 200; Carl Zeiss | B 40-080 | |
Fura-2 AM | Molecular Probes | F1221 | Ratiometric Ca2+ indicator |
Gentamicin Sulfate | Calbiochem | 1405-41-0 | antibiotics |
HEPES | Sigma | H4034 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
Lambda DG-4 apparatus | Sutter Instrument, Novato, CA | DG-4PLUS/OF30 | |
Laminin | Gibco | 23017-015 | Help cell adhesion |
Metafluor software | Universal Imaging Corp. West Chester, PA | ||
MgCl2 | Sigma | M4880 | |
Na2HPO4 | Vetec | 129 | |
NaCl | Isofar | 310 | |
NaHCO3 | Vetec | 306 | |
PH3 platform | Warner Intruments, Hamden, CT | 64-0286 | |
Pluronic F-127 | Molecular Probes | P6866 | nonionic, surfactant |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Help cell adhesion |
Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | Dissociation enzyme |