הדמיה של שינויים במעגל נוירון-גליה בטכניקת הדמיית הסידן
Summary
הדמיית סידן תאים היא מתודולוגיה רב-תכליתית לחקר איתות דינמי של תאים בודדים, על אוכלוסיות מעורבות בתרבית או אפילו על בעלי חיים מתעוררים, המבוססת על הביטוי של ערוצים / קולטנים חדירים לסידן המעניקים חתימות פונקציונליות ייחודיות.
Abstract
כאן, אנו מדווחים על מודלים סלקטיביים במבחנה של מעגלים המבוססים על גליה (אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים ומיקרוגליה) ו / או נוירונים מציוד היקפי (גרעיני שורש הגב) ורקמות מרכזיות (קליפת המוח, אזור תת-חדרי, אורגנויד) הנחקרים באופן דינמי במונחים של שינויי סידן. המודל שנבחר כדי להמחיש את התוצאות הוא הרשתית, רקמה פשוטה עם אינטראקציות תאיות מורכבות. סידן הוא שליח אוניברסלי המעורב ברוב התפקידים התאיים החשובים. אנו מסבירים בפרוטוקול שלב אחר שלב כיצד תאי נוירון-גליה ברשתית בתרבית יכולים להיות מוכנים ומוערך, לדמיין שינויי סידן. במודל זה, אנו מבדילים נוירונים מגליה בהתבסס על התגובה הסלקטיבית שלהם ל- KCl ו- ATP. קולטנים חדירים סידן וערוצים באים לידי ביטוי באופן סלקטיבי בתאים שונים. כדי לנתח תגובות סידן, אנו משתמשים במתים פלואורסצנטיים יחסיים כגון Fura-2. בדיקה זו מכמתת ריכוז Ca2+ חופשי המבוסס על צורות Ca2+ ללא Ca2 + ו- Ca2 + מאוגדות, ומציגה שתי פסגות שונות, המבוססות על עוצמת הפלואורסצנטיות הנתפסת בשני אורכי גל.
Introduction
בשל התכונות האוניברסליות של סידן כשליח שני, יון זה מעורב במספר עצום של פעילויות איתות: שעתוק גנים, לידה ומוות, התפשטות, הגירה ובידול, שידור סינפטי ופלסטיות. לפיכך, שיטה המסוגלת לעקוב אחר דינמיקת הפעלת הסידן בנאמנות וזריזות תספק דרך להתבונן בתגובות מרחביות-זמניות ייחודיות. שיטה כזו היא טכניקת הדמיית הסידן התאית, אשר מתאמת סידן מעביר נתונים פונקציונליים עם פנוטיפים ספציפיים של התא בהתבסס על התגובות הייחודיות שלהם.
בדיקות Ca2+ פותחו לראשונה בשנות השמונים, עם שיפורים מאוחרים יותר המאפשרים שימוש במולקולות אלה בבדיקות תאים חיים1. כאינדיקטור כימי, Fura-2 נחשב לסטנדרט למדידות כמותיות [Ca2+]i. אסתר האצטוקסימתיל (AM) של מחוון זה (כלומר, Fura-2 AM) מחלחלת בקלות לקרום התא ויכולה להגיע לריכוזים תאיים גדולים פי 20 מדילול הדגירה (למשל, [5 μM]o/[100 μM]i). יתרון נוסף של Fura-2 הוא שיש לו התנגדות טובה להלבנה פוטו; לפיכך, הדמיית אינדיקטור זה לפרקי זמן ארוכים יותר לא תשפיע רבות על יכולות הפלואורסצנטיות שלה. לבסוף, Fura-2 רגיש למגוון רחב של רמות סידן, מ ~ 100 nM כדי ~ 100 מיקרומטר, ויש לו Kd של ~ 145 nM, אשר דומה למנוחה [Ca2 +]i2. מאוחר יותר, הדמיית סידן התא פותחה עם מיקרוסקופים פלואורסצנטיים טובים יותר ושיטות חישוב, יחד עם בדיקות יחס שאינן מושפעות מטעינת צבע.
כל תא מבטא התקני סידן שונים (משאבות, מובילים, קולטנים וערוצים) התורמים לתגובה הסופית כחתימה מסוימת. הטיפ החשוב הוא למצוא תגובות סלקטיביות של סוגים שונים של תאים בקורלציה עם הביטוי הפנוטיפי שלהם. בהתאם לכך, ישנם לפחות שני קולטנים שונים הפועלים באמצעות משמרות סידן: קולטנים יונוטרופיים המחלחלים Ca2 + במצב מהיר וקולטנים מטבוטרופיים איטיים בשילוב מסלולי איתות ומלאי תאיים המשחררים Ca2 + מופעל על ידי שליחים שניים, כגון אינוזיטול טריפוספט ו ADP-ריבוז מחזורי3.
לדוגמה, תאי אב מבטאים nestin ברשתית לא בוגרת ולהראות קולטני GABAA depolarized על ידי גאבא (או muscimol)4. זה קורה בשל שיפוע Cl– אלקטרוכימי עם רמות Cl − תאיות גבוהות; כמו הרקמה מתפתחת, מובילי KCC2 לעבור עירור על אבות לעיכוב על נוירונים GABAergic בוגר5. מצד שני, תאי גזע המבטאים sox-2 באזור תת-חדרי לא בוגר (SVZ) של מכרסמים לאחר הלידה מציגים גם קולטני H1 מטבוטרופיים המופעלים על ידי היסטמין הגדלת Ca2 + בצורה איטית6. קולטן מטבוטרופי שני ממשפחת קולטן-1 המופעלת על ידי פרוטאז (PAR-1), המופעל על ידי תרומבין ובמורד הזרם ל- G(q/11) ופוספוליפאז C (PLC), נותן משמרות Ca2 + איטיות באוליגודנדרוציטים (המבטאים O4 ו- PLP) הנוצרים מתאי עצב גזע SVZ מרובים7.
באופן כללי, נוירונים מבטאים ערוצי סידן תלויי מתח, כמו גם קולטני נוירוטרנסמיטר עיקריים חדיר Ca2 +, כמו גלוטמטרגי (אמפא, NMDA, kainate) וקולטנים היקפיים ומרכזיים nicotinic. אשלגן כלורי משמש בדרך כלל כסוכן depolarizing להפעלת נוירונים היקפיים, כמו נוירונים גנגליון שורש הגב8 או נוירונים מרכזיים, כמו מאזור subventricular9 או רשתית10. מצד שני, ATP מוכר כמו gliotransmitter העיקרי (בנוסף D-serine), אשר מפעיל חברי Ca2 + חדירים סלקטיביים P2X, כמו P2X7 ו P2X4. שני הקולטנים מציגים זרמי Ca2+ מקבילים, בדומה לאלה המוצגים על ידי קולטני NMDA המוכרים כזרמי Ca2 + הגדולים ביותר המופעלים על ידי משדרים11. קולטני P2X7 באים לידי ביטוי מאוד על מיקרוגליה, אבל בצפיפות נמוכה יותר על אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים, שיש להם תפקיד בשחרור של ציטוקינים פרו-דליקים12. קולטני P2X7 באים לידי ביטוי גם על תאי Schwann13 ו Müller גליה ברשתית14,15.
הרשתית ידועה להראות כמעט את כל המשדרים שנראו במוח. לדוגמה, הציר האנכי (קולטני אור, תאי גנגליון דו קוטביים ורשתית) הוא בעיקר גלוטמטרגי, עם קולטני אמפא חדירים לסידן או kainate המתבטאים בתאים OFF-דו-קוטביים ו- mgluR6 המתבטאים בתאים דו-קוטביים 16. באופן מוזר, כל שלושת הקולטנים נמצאים גם מולר גליה, אשר מצמידים סידן ואינוזיטול טריפוספט מסלולים17,18. ציר מעכב אופקי, שנעשו על ידי תאים אופקיים amacrine, להפריש לא רק גאבא, אלא גם דופמין, אצטילכולין, נוירוטרנסמיטורים קלאסיים אחרים. תאי Amacrine הם הסוגים העיקריים של תאים שנמצאו בתרביות רשתית העופות, מראה מספר סוגים של ערוצים המופעלים על ידי סידן, כמו glutamatergic, purinergic, ניקוטיני ומתח תלוי סידן תעלות סידן. מסיבה זו, זהו מודל מצוין להערכת תכונות שונות של סידן משתנה בין נוירונים גליה.
לכן, השילוב של קולטנים וערוצים שונים הסתכם סמנים פנוטיפיים סלקטיביים במהלך הפיתוח עם דפוסי תגובה אגוניסטיים ברורים מאפשר חתימות ייחודיות גזע, אב, נוירון, אסטרוציט, אוליגודנדרוציטים, ומיקרוגליה הפועלים באמצעות התקני איתות סלקטיביים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השתמשנו ברקמת הרשתית כדי להראות שתגובות הסידן בתיווך KCl או ATP ממודרות בבירור לתגובות עצביות וגליות, בהתאמה (איור 1). למרות כמה נתונים בספרות לרמוז כי קולטני P2X7 באים לידי ביטוי נוירונים, אשר לווסת את הפעילות העצבית ואת שחרור נוירוטרנסמיטר סינפטי 20, מחברים אחרים מ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מענקים, נותני חסות ומקורות מימון: MH מקבל מלגת CNPq לדוקטורט. HRF מקבל מלגת פוסט-דוקטורט הנתמכת על ידי CNPq (מספר מענק HRF 152071/2020-2). RAMR נתמך על ידי CNPq ו- FAPERJ (מספרי מענק E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 ו-312157/2016-9 ו-INCT-INNT (המכון הלאומי למדעי המוח התרגומיים).
Materials
| 15 mm coverslip | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111550 | Cell suport |
| 510 nm long-pass filter | Carl Zeiss | ||
| ATP | Sigma | A1852 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Suplement |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| CoolSNAP digital camera | Roper Scientific, Trenton, NJ | ||
| D-(+)-Glucose | Neon | 1466 | |
| DMEM/ F-12 | Gibco | 12400-24 | Cell culture medium |
| Excel Software | Microsoft | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Suplement |
| Fluorescence Microscope | Axiovert 200; Carl Zeiss | B 40-080 | |
| Fura-2 AM | Molecular Probes | F1221 | Ratiometric Ca2+ indicator |
| Gentamicin Sulfate | Calbiochem | 1405-41-0 | antibiotics |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Lambda DG-4 apparatus | Sutter Instrument, Novato, CA | DG-4PLUS/OF30 | |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Help cell adhesion |
| Metafluor software | Universal Imaging Corp. West Chester, PA | ||
| MgCl2 | Sigma | M4880 | |
| Na2HPO4 | Vetec | 129 | |
| NaCl | Isofar | 310 | |
| NaHCO3 | Vetec | 306 | |
| PH3 platform | Warner Intruments, Hamden, CT | 64-0286 | |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P6866 | nonionic, surfactant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Help cell adhesion |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | Dissociation enzyme |
Referências
- Tsien, R. Y., Pozzan, T., Rink, T. J. Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator. Journal of Cell Biology. 94 (2), 325-334 (1982).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Islam, M. S. Calcium Signaling: From Basic to Bedside. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1131, 1-6 (2020).
- De Melo Reis, R. A., et al. Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging. Cellular and Molecular Neurobiology. 31 (6), 835-846 (2011).
- Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., Poo, M. GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition. Cell. 105 (4), 521-532 (2001).
- Schitine, C., et al. Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures. European Journal of Neuroscience. 35 (11), 1672-1683 (2012).
- Xapelli, S., et al. Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).
- Ribeiro-Resende, V. T., et al. Mice lacking GD3 synthase display morphological abnormalities in the sciatic nerve and neuronal disturbances during peripheral nerve regeneration. PLoS One. 9 (10), 108919 (2014).
- Xapelli, S., et al. Activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R) promotes neurogenesis in murine subventricular zone cell cultures. PLoS One. 8 (5), 63529 (2013).
- Kubrusly, R. C. C., et al. Neuro-glial cannabinoid receptors modulate signaling in the embryonic avian retina. Neurochemistry International. 112, 27-37 (2018).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. Journal of Neuroscience. 24 (13), 3413-3420 (2004).
- Illes, P. P2X7 Receptors Amplify CNS Damage in Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).
- Faroni, A., et al. Purinergic signaling mediated by P2X7 receptors controls myelination in sciatic nerves. Journal of Neuroscience Research. 92 (10), 1259-1269 (2014).
- Freitas, H. R., et al. Cannabinoids Induce Cell Death and Promote P2X7 Receptor Signaling in Retinal Glial Progenitors in Culture. Molecular Neurobiology. 56 (9), 6472-6486 (2019).
- Freitas, H. R., et al. Glutathione-Induced Calcium Shifts in Chick Retinal Glial Cells. PLoS One. 11 (4), 0153677 (2016).
- Yang, X. L. Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal neurons. Progress in Neurobiology. 73 (2), 127-150 (2004).
- Reis, R. A., Kubrusly, R. C., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Transient coupling of NMDA receptor with ip3 production in cultured cells of the avian retina. Neurochemistry International. 26 (4), 375-380 (1995).
- López-Colomé, A. M., Ortega, A., Romo-de-Vivar, M. Excitatory amino acid-induced phosphoinositide hydrolysis in Müller glia. Glia. 9 (2), 127-135 (1993).
- Ventura, A. L., de Mello, F. G., de Melo Reis, R. A. Methods of dopamine research in retina cells. Methods in Molecular Biology. 964, 25-42 (2013).
- Miras-Portugal, M. T., Sebastián-Serrano, &. #. 1. 9. 3. ;., de Diego García, L., Díaz-Hernández, M. Neuronal P2X7 Receptor: Involvement in Neuronal Physiology and Pathology. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7063-7072 (2017).
- Illes, P., Khan, T. M., Rubini, P. Neuronal P2X7 Receptors Revisited: Do They Really Exist. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7049-7062 (2017).
- Schitine, C. S., et al. Functional plasticity of GAT-3 in avian Müller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input. Neurochemistry International. 82, 42-51 (2015).
- Ferreira, D. D., Stutz, B., de Mello, F. G., Reis, R. A., Kubrusly, R. C. Caffeine potentiates the release of GABA mediated by NMDA receptor activation: Involvement of A1 adenosine receptors. Neurociência. 281, 208-215 (2014).
- Faria, R. X., Freitas, H. R., Reis, R. A. M. P2X7 receptor large pore signaling in avian Müller glial cells. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 215-229 (2017).
- Passos, A., et al. Regulation of the Serotonergic System by Kainate in the Avian Retina. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 1039-1049 (2019).
- de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L., Schitine, C. S., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors. Neurochemical Research. 33 (8), 1466-1474 (2008).
- Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers in Neuroscience. 9, 499. 9, 499 (2015).
