कैल्शियम इमेजिंग तकनीक के साथ न्यूरॉन-ग्लिया सर्किट पर शिफ्ट की कल्पना करना
Summary
सेल कैल्शियम इमेजिंग व्यक्तिगत कोशिकाओं के गतिशील सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी पद्धति है, संस्कृति में मिश्रित आबादी पर या यहां तक कि जागृत जानवरों पर, कैल्शियम-पारगम्य चैनलों / रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति के आधार पर जो अद्वितीय कार्यात्मक हस्ताक्षर देता है।
Abstract
यहां, हम ग्लिया (एस्ट्रोसाइट्स, ओलिगोडेंड्रोसाइट्स, और माइक्रोग्लिया) और / या परिधीय (पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया) और केंद्रीय ऊतकों (कॉर्टेक्स, सबवेंट्रिकुलर ज़ोन, ऑर्गेनोइड) से न्यूरॉन्स के आधार पर सर्किट के चुनिंदा इन विट्रो मॉडल पर रिपोर्ट करते हैं जो कैल्शियम शिफ्ट के संदर्भ में गतिशील रूप से अध्ययन किए जाते हैं। परिणामों को स्पष्ट करने के लिए चुना गया मॉडल रेटिना है, जो जटिल सेलुलर इंटरैक्शन के साथ एक सरल ऊतक है। कैल्शियम एक सार्वभौमिक संदेशवाहक है जो अधिकांश महत्वपूर्ण सेलुलर भूमिकाओं में शामिल है। हम एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल में बताते हैं कि संस्कृति में रेटिना न्यूरॉन-ग्लियाल कोशिकाओं को कैल्शियम बदलाव की कल्पना करते हुए कैसे तैयार और मूल्यांकन किया जा सकता है। इस मॉडल में, हम केसीएल और एटीपी के लिए उनकी चयनात्मक प्रतिक्रिया के आधार पर ग्लिया से न्यूरॉन्स को अलग करते हैं। कैल्शियम पारगम्य रिसेप्टर्स और चैनलों को चुनिंदा रूप से विभिन्न डिब्बों में व्यक्त किया जाता है। कैल्शियम प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए, हम रेशियोमेट्रिक फ्लोरोसेंट मर जाता है जैसे कि फुरा -2 का उपयोग करते हैं। यह जांच Ca2 + मुक्त और Ca2 + – बाध्य रूपों के आधार पर मुक्त Ca2 + एकाग्रता को निर्धारित करती है, दो अलग-अलग चोटियों को प्रस्तुत करती है, जो दो तरंग दैर्ध्य पर कथित प्रतिदीप्ति तीव्रता पर स्थापित होती है।
Introduction
एक दूसरे दूत के रूप में कैल्शियम के सार्वभौमिक गुणों के कारण, यह आयन बड़ी संख्या में सिग्नलिंग गतिविधियों में शामिल है: जीन प्रतिलेखन, जन्म और मृत्यु, प्रसार, प्रवासन और भेदभाव, सिनैप्टिक ट्रांसमिशन और प्लास्टिसिटी। इसलिए, निष्ठा और चपलता के साथ कैल्शियम सक्रियण गतिशीलता को ट्रैक करने में सक्षम एक विधि अद्वितीय स्थानिक-अस्थायी प्रतिक्रियाओं का निरीक्षण करने का एक तरीका प्रदान करेगी। इस तरह की एक विधि सेलुलर कैल्शियम इमेजिंग तकनीक है, जो कैल्शियम शिफ्ट कार्यात्मक डेटा को उनकी अलग-अलग प्रतिक्रियाओं के आधार पर विशिष्ट सेल फेनोटाइप के साथ जोड़ती है।
Ca2+ जांच को पहली बार 1980 के दशक में विकसित किया गया था, बाद में सुधार के साथ इन अणुओं को लाइव सेल assays1 में उपयोग करने की अनुमति दी गई थी। एक रासायनिक संकेतक के रूप में, Fura-2 को मात्रात्मक [Ca2+] i माप के लिए मानक माना जाता है। इस संकेतक का एसिटोक्सिमिथाइल (एएम) एस्टर (यानी, फुरा -2 एएम) आसानी से सेल झिल्ली में प्रवेश करता है और इनक्यूबेशन कमजोर पड़ने की तुलना में 20 गुना अधिक इंट्रासेल्युलर सांद्रता तक पहुंच सकता है (उदाहरण के लिए, [5 μM] o / [100 μM]i)। फुरा -2 का एक और लाभ यह है कि इसमें अच्छा फोटोब्लीचिंग प्रतिरोध है; इस प्रकार, लंबे समय तक इस संकेतक को इमेजिंग करने से इसकी प्रतिदीप्ति क्षमताओं पर बहुत प्रभाव नहीं पड़ेगा। अंत में, Fura-2 कैल्शियम के स्तर की एक विस्तृत श्रृंखला के प्रति संवेदनशील है, ~ 100 nM से ~ 100 μM तक, और ~ 145 nM का एक KD है, जो आराम करने के लिए तुलनीय है [Ca2+] i2। बाद में, सेल कैल्शियम इमेजिंग को बेहतर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप और गणना विधियों के साथ विकसित किया गया था, साथ ही साथ रेशियोमेट्रिक जांच के साथ जो डाई लोडिंग से प्रभावित नहीं होते हैं।
प्रत्येक सेल विभिन्न कैल्शियम उपकरणों (पंप, ट्रांसपोर्टर, रिसेप्टर्स और चैनलों) को व्यक्त करता है जो एक विशेष हस्ताक्षर के रूप में अंतिम प्रतिक्रिया में योगदान करते हैं। महत्वपूर्ण टिप विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की चयनात्मक प्रतिक्रियाओं को ढूंढना है जो उनके फेनोटाइपिक अभिव्यक्ति के साथ सहसंबद्ध हैं। तदनुसार, कम से कम दो अलग-अलग रिसेप्टर्स हैं जो कैल्शियम शिफ्ट के माध्यम से काम करते हैं: आयनोट्रोपिक रिसेप्टर्स जो Ca2 + को एक तेज मोड में प्रवेश करते हैं और धीमी गति से मेटाबोट्रोपिक रिसेप्टर्स सिग्नलिंग मार्गों और इंट्रासेल्युलर स्टॉक के लिए युग्मित होते हैं जो Ca2 + को दूसरे दूतों द्वारा सक्रिय करते हैं, जैसे कि इनोसिटोल ट्राइफॉस्फेट और चक्रीय एडीपी-राइबोज़ 3।
उदाहरण के लिए, पूर्वज कोशिकाएं अपरिपक्व रेटिना में नेस्टिन व्यक्त करती हैं और गाबा रिसेप्टर्स को गाबा (या म्यूसिमोल) 4 द्वारा विध्रुवीकृत दिखाती हैं। यह उच्च इंट्रासेल्युलर Cl– स्तरों के साथ Cl– इलेक्ट्रोकेमिकल ग्रेडिएंट के कारण होता है; के रूप में ऊतक विकसित होता है, KCC2 ट्रांसपोर्टरों परिपक्व GABaergic न्यूरॉन्स 5 पर निषेध करने के लिए पूर्वजों पर उत्तेजना से स्विच। दूसरी ओर, स्टेम कोशिकाएं जो प्रसवोत्तर कृन्तकों के अपरिपक्व सबवेंट्रिकुलर ज़ोन (एसवीजेड) पर सोक्स -2 व्यक्त करती हैं, वे हिस्टामाइन द्वारा सक्रिय मेटाबोट्रोपिक एच 1 रिसेप्टर्स को भी धीमी गति से Ca2 + को बढ़ाने वाले मेटाबोट्रोपिक एच 1 रिसेप्टर्स को प्रस्तुत करती हैं। प्रोटीज-सक्रिय रिसेप्टर -1 (PAR-1) परिवार से एक दूसरा मेटाबोट्रोपिक रिसेप्टर, थ्रोम्बिन द्वारा सक्रिय और डाउनस्ट्रीम को G (q / 11) और फॉस्फोलिपिस C (PLC) के लिए सक्रिय किया गया है, ओलिगोडेंड्रोसाइट्स (जो कि O4 और PLP को व्यक्त करता है) में धीमी गति से Ca2 + बदलाव देता है जो बहुशक्तिमान SVZ तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न होता है।
सामान्य तौर पर, न्यूरॉन्स वोल्टेज-निर्भर कैल्शियम चैनलों के साथ-साथ Ca2+ के लिए पारगम्य प्रमुख न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स को व्यक्त करते हैं, जैसे ग्लूटामेटर्जिक (एएमपीए, एनएमडीए, कैनेट) और परिधीय और केंद्रीय निकोटिनिक रिसेप्टर्स। पोटेशियम क्लोराइड का उपयोग आमतौर पर परिधीय न्यूरॉन्स को सक्रिय करने के लिए एक विध्रुवीकरण एजेंट के रूप में किया जाता है, पृष्ठीय रूट गैंग्लियन न्यूरॉन्स 8 या केंद्रीय न्यूरॉन्स के रूप में, जैसा कि सबवेंट्रिकुलर ज़ोन 9 या रेटिना 10 से होता है। दूसरी ओर, एटीपी को प्रमुख ग्लियोट्रांसमीटर (डी-सेरीन के अलावा) के रूप में स्वीकार किया जाता है, जो चयनात्मक Ca2 + पारगम्य P2X सदस्यों को P2X7 और P2X4 के रूप में सक्रिय करता है। दोनों रिसेप्टर्स समतुल्य Ca2 + धाराओं को प्रस्तुत करते हैं, जो NMDA रिसेप्टर्स द्वारा दिखाए गए लोगों के समान होते हैं, जिन्हें ट्रांसमीटर11 द्वारा सक्रिय सबसे बड़े Ca2 + धाराओं के रूप में स्वीकार किया जाता है। P2X7 रिसेप्टर्स को माइक्रोग्लिया पर अत्यधिक व्यक्त किया जाता है, लेकिन एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेंड्रोसाइट्स पर कम घनत्व पर, प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स 12 की रिहाई में भूमिका निभाते हैं। P2X7 रिसेप्टर्स भी श्वान कोशिकाओं 13 और मुलर ग्लिया पर रेटिना 14,15 में व्यक्त किए जाते हैं।
रेटिना मस्तिष्क में देखे जाने वाले लगभग सभी ट्रांसमीटरों को दिखाने के लिए जाना जाता है। उदाहरण के लिए, ऊर्ध्वाधर अक्ष (फोटोरिसेप्टर, द्विध्रुवी और रेटिना गैंग्लियन कोशिकाएं) मुख्य रूप से ग्लूटामेटर्जिक है, जिसमें कैल्शियम-पारगम्य एएमपीए या कैनेट रिसेप्टर्स ऑफ-द्विध्रुवी कोशिकाओं में व्यक्त किए जाते हैं और mgluR6 ऑन-द्विध्रुवी कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। दिलचस्प बात यह है कि सभी तीन रिसेप्टर्स मुलर ग्लिया में भी पाए जाते हैं, जो कैल्शियम और इनोसिटोल ट्राइफॉस्फेट मार्ग17,18 के साथ युग्मित होते हैं। क्षैतिज निरोधात्मक अक्ष, क्षैतिज और amacrine कोशिकाओं द्वारा बनाया गया है, न केवल गाबा, बल्कि डोपामाइन, acetylcholine, और अन्य शास्त्रीय न्यूरोट्रांसमीटर भी स्रावित। एमैक्रिन कोशिकाएं एवियन रेटिना संस्कृतियों में पाई जाने वाली मुख्य प्रकार की कोशिकाएं हैं, जो कई प्रकार के कैल्शियम संचालित चैनलों को दिखाती हैं, जैसे ग्लूटामेटर्जिक, प्यूरिनर्जिक, निकोटिनिक और वोल्टेज निर्भर कैल्शियम चैनल। इस कारण से, यह न्यूरॉन्स और ग्लिया के बीच कैल्शियम शिफ्ट के विभिन्न गुणों का मूल्यांकन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है।
इसलिए, अलग-अलग एगोनिस्ट प्रतिक्रिया पैटर्न के साथ विकास के दौरान चुनिंदा फेनोटाइपिक मार्करों के लिए अभिव्यक्त विभिन्न रिसेप्टर्स और चैनलों का संयोजन स्टेम, पूर्वज, न्यूरॉन, एस्ट्रोसाइट्स, ओलिगोडेंड्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया में अद्वितीय हस्ताक्षर की अनुमति देता है जो चयनात्मक सिग्नलिंग उपकरणों के माध्यम से काम करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने रेटिना ऊतक का उपयोग यह दिखाने के लिए किया है कि केसीएल या एटीपी द्वारा मध्यस्थता की गई कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को स्पष्ट रूप से क्रमशः न्यूरोनल और ग्लियल प्रतिक्रियाओं में विभाजित किया जाता है (<str…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अनुदान, प्रायोजक, और वित्त पोषण स्रोत: एमएच पीएचडी CNPq फैलोशिप का प्राप्तकर्ता है। HRF CNPq (HRF अनुदान संख्या 152071/2020-2) द्वारा समर्थित एक पोस्टडॉक फैलोशिप का प्राप्तकर्ता है। RAMR CNPq और FAPERJ (अनुदान संख्या E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 और 312157/2016-9 और INCT-INNT (नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर ट्रांसलेशनल न्यूरोसाइंस) द्वारा समर्थित है।
Materials
| 15 mm coverslip | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111550 | Cell suport |
| 510 nm long-pass filter | Carl Zeiss | ||
| ATP | Sigma | A1852 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Suplement |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| CoolSNAP digital camera | Roper Scientific, Trenton, NJ | ||
| D-(+)-Glucose | Neon | 1466 | |
| DMEM/ F-12 | Gibco | 12400-24 | Cell culture medium |
| Excel Software | Microsoft | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Suplement |
| Fluorescence Microscope | Axiovert 200; Carl Zeiss | B 40-080 | |
| Fura-2 AM | Molecular Probes | F1221 | Ratiometric Ca2+ indicator |
| Gentamicin Sulfate | Calbiochem | 1405-41-0 | antibiotics |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Lambda DG-4 apparatus | Sutter Instrument, Novato, CA | DG-4PLUS/OF30 | |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Help cell adhesion |
| Metafluor software | Universal Imaging Corp. West Chester, PA | ||
| MgCl2 | Sigma | M4880 | |
| Na2HPO4 | Vetec | 129 | |
| NaCl | Isofar | 310 | |
| NaHCO3 | Vetec | 306 | |
| PH3 platform | Warner Intruments, Hamden, CT | 64-0286 | |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P6866 | nonionic, surfactant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Help cell adhesion |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | Dissociation enzyme |
Referências
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