Visualisera skift på Neuron-Glia-kretsen med kalciumavbildningstekniken
Summary
Cellkalciumavbildning är en mångsidig metod för att studera dynamisk signalering av enskilda celler, på blandade populationer i kultur eller till och med på uppvaknade djur, baserat på uttryck av kalciumgenomsläppliga kanaler/receptorer som ger unika funktionella signaturer.
Abstract
Här rapporterar vi om selektiva in vitro-modeller av kretsar baserade på glia (astrocyter, oligodendrocyter och mikroglia) och/eller nervceller från perifera (dorsala rot ganglier) och centrala vävnader (cortex, subventrikulära zonen, organoid) som studeras dynamiskt när det gäller kalciumskiften. Den modell som valts för att illustrera resultaten är näthinnan, en enkel vävnad med komplexa cellulära interaktioner. Kalcium är en universell budbärare som är involverad i de flesta av de viktiga cellulära rollerna. Vi förklarar i ett steg-för-steg-protokoll hur retinala neuron-gliaceller i kultur kan förberedas och utvärderas, föreställa sig kalciumskiften. I denna modell skiljer vi nervceller från glia baserat på deras selektiva svar på KCl och ATP. Kalciumgenomsläppliga receptorer och kanaler uttrycks selektivt i olika fack. För att analysera kalciumsvar använder vi ratiometriska fluorescerande matriser som Fura-2. Denna sond kvantifierar fri Ca2+ koncentration baserad på Ca2+-fria och Ca2+-bundna former, som presenterar två olika toppar, grundade på fluorescensintensiteten som uppfattas på två våglängder.
Introduction
På grund av de universella egenskaperna hos kalcium som en andra budbärare är denna jon involverad i ett stort antal signaleringsaktiviteter: gen transkription, födelse och död, spridning, migration och differentiering, synaptisk överföring och plasticitet. Därför skulle en metod som kan spåra kalciumaktiveringsdynamik med återgivning och smidighet ge ett sätt att observera unika rumsliga-temporala svar. En sådan metod är den cellulära kalciumavbildningstekniken, som korrelerar kalcium skiftar funktionella data med specifika cellfenotyper baserat på deras distinkta svar.
Ca2+ sonder utvecklades först på 1980-talet, med senare förbättringar som gör att dessa molekyler kan användas i levande cellanalyser1. Som kemisk indikator anses Fura-2 vara standard för kvantitativa [Ca2+]i-mätningar. Acetoximetylestern (AM) för denna indikator (dvs. Fura-2 AM) genomsyrar lätt cellmembranet och kan nå intracellulära koncentrationer som är 20 gånger större än inkubationsutspädningen (t.ex. [5 μM]o/[100 μM]i). En annan fördel med Fura-2 är att den har bra fotobleaching motstånd; Således kommer avbildning av denna indikator under längre tidsperioder inte att påverka dess fluorescensförmåga i någon större utsträckning. Slutligen är Fura-2 känslig för ett brett spektrum av kalciumnivåer, från ~ 100 nM till ~ 100 μM, och har en Kd på ~ 145 nM, vilket är jämförbart med vila [Ca2 +]i2. Senare utvecklades cellkalcium imaging med bättre fluorescerande mikroskop och beräkningsmetoder, tillsammans med ratiometriska sonder som inte påverkas av färgbelastning.
Varje cell uttrycker olika kalciumenheter (pumpar, transportörer, receptorer och kanaler) som bidrar till det slutliga svaret som en viss signatur. Det viktiga tipset är att hitta selektiva svar av olika typer av celler korrelerade med deras fenotypiska uttryck. Följaktligen finns det minst två olika receptorer som verkar genom kalciumförskjutningar: jonotropa receptorer som genomsyrar Ca2 + i ett snabbt läge och långsamma metabotropiska receptorer kopplade till signalvägar och intracellulära lager som frigör Ca2 + aktiverat av andra budbärare, såsom inositoltrifosfat och cyklisk ADP-ribose3.
Till exempel, stamceller uttrycker nestin i den omogna näthinnan och visar GABAA-receptorer depolariserade av GABA (eller muscimol)4. Detta händer på grund av cl– elektrokemisk gradient med höga intracellulära Cl− nivåer; när vävnaden utvecklas växlar KCC2-transportörer från excitation på stamceller till hämning på mogna GABAergic nervceller5. Å andra sidan presenterar stamceller som uttrycker sox-2 vid den omogna subventrikulära zonen (SVZ) av postnatala gnagare också metabotropiska H1-receptorer som aktiveras av histamin ökar Ca2 + på ett långsamt sätt6. En andra metabotropisk receptor från den proteasaktiverade receptorn-1 (PAR-1) familjen, aktiverad av trombin och nedströms till G(q/11) och fosfolipas C (PLC), ger långsamma Ca2+ skiftningar i oligodendrocyter (som uttrycker O4 och PLP) som genereras från multipotenta SVZ neurala stamceller7.
I allmänhet uttrycker nervceller spänningsberoende kalciumkanaler samt stora signalsubstansreceptorer som är genomsläppliga för Ca2+, som glutamatergiska (AMPA, NMDA, kainate) och perifera och centrala nikotinreceptorer. Kaliumklorid används vanligtvis som ett depolariserande medel för att aktivera perifera nervceller, som dorsala rot ganglion nervceller8 eller centrala nervceller, från subventrikulära zon9 eller näthinnan10. Å andra sidan erkänns ATP som den stora gliotransmitter (förutom D-serin), som aktiverar selektiv Ca2 + genomsläppliga P2X-medlemmar, som P2X7 och P2X4. Båda receptorerna uppvisar motsvarande Ca2+ strömmar, liknande de som visas av NMDA-receptorer som erkänns som de största Ca2 + strömmarna som aktiveras av sändare11. P2X7-receptorer uttrycks starkt på mikroglia, men vid en lägre densitet på astrocyter och oligodendrocyter, med en roll i frisättningen av proinflammatoriska cytokiner12. P2X7-receptorer uttrycks också på Schwannceller13 och Müller glia i näthinnan14,15.
Näthinnan är känd för att visa nästan alla sändare som ses i hjärnan. Till exempel är den vertikala axeln (fotoreceptorer, bipolära och retinala ganglionceller) huvudsakligen glutamatergisk, med kalciumgenomsläppliga AMPA- eller kainatereceptorer uttryckta i OFF-bipolära celler och mgluR6 uttryckt i ON-bipolära celler16. Märkligt nog finns alla tre receptorerna också i Müller glia, som är kopplade till kalcium- och inositoltrifosfatvägar17,18. Den horisontella hämmande axeln, gjord av horisontella och amacrine celler, utsöndrar inte bara GABA, men också dopamin, acetylkolin, och andra klassiska signalsubstanser. Amacrine celler är de viktigaste typerna av celler som finns i fågel retinal kulturer, visar flera typer av kalciumdrivna kanaler, som glutamatergic, purinergic, nikotin och spänning beroende kalcium kanaler. Av denna anledning är detta en utmärkt modell för att utvärdera olika egenskaper hos kalciumskiften bland nervceller och glia.
Därför tillåter kombinationen av olika receptorer och kanaler som summeras till selektiva fenotypiska markörer under utveckling med distinkta agonistiska svarsmönster unika signaturer i stam, stamceller, neuron, astrocyt, oligodendrocyt och mikroglia som fungerar genom selektiva signalanordningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har använt näthinnan vävnad för att visa att kalcium svar medieras av KCl eller ATP är tydligt uppdelade i neuronal och glia svar, respektive (figur 1). Även om vissa data i litteraturen innebär att P2X7-receptorer uttrycks i nervceller, som reglerar neuronal aktivitet och synaptisk neurotransmittor release20, ifrågasätter andra författare förekomsten av neuronala P2X7-receptorer. Faktum är att nuvarande resultat upprätthåller tanken att primära glia…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bidrag, sponsorer och finansieringskällor: MH är mottagare av ett phd CNPq-stipendium. HRF är mottagare av ett postdoktorstipendium som stöds av CNPq (HRF-bidragsnummer 152071/2020-2). RAMR stöds av CNPq och FAPERJ (bidragsnummer E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 och 312157/2016-9 och INCT-INNT (National Institute for Translational Neuroscience).
Materials
| 15 mm coverslip | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111550 | Cell suport |
| 510 nm long-pass filter | Carl Zeiss | ||
| ATP | Sigma | A1852 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Suplement |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| CoolSNAP digital camera | Roper Scientific, Trenton, NJ | ||
| D-(+)-Glucose | Neon | 1466 | |
| DMEM/ F-12 | Gibco | 12400-24 | Cell culture medium |
| Excel Software | Microsoft | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Suplement |
| Fluorescence Microscope | Axiovert 200; Carl Zeiss | B 40-080 | |
| Fura-2 AM | Molecular Probes | F1221 | Ratiometric Ca2+ indicator |
| Gentamicin Sulfate | Calbiochem | 1405-41-0 | antibiotics |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Lambda DG-4 apparatus | Sutter Instrument, Novato, CA | DG-4PLUS/OF30 | |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Help cell adhesion |
| Metafluor software | Universal Imaging Corp. West Chester, PA | ||
| MgCl2 | Sigma | M4880 | |
| Na2HPO4 | Vetec | 129 | |
| NaCl | Isofar | 310 | |
| NaHCO3 | Vetec | 306 | |
| PH3 platform | Warner Intruments, Hamden, CT | 64-0286 | |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P6866 | nonionic, surfactant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Help cell adhesion |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | Dissociation enzyme |
Referências
- Tsien, R. Y., Pozzan, T., Rink, T. J. Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator. Journal of Cell Biology. 94 (2), 325-334 (1982).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Islam, M. S. Calcium Signaling: From Basic to Bedside. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1131, 1-6 (2020).
- De Melo Reis, R. A., et al. Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging. Cellular and Molecular Neurobiology. 31 (6), 835-846 (2011).
- Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., Poo, M. GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition. Cell. 105 (4), 521-532 (2001).
- Schitine, C., et al. Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures. European Journal of Neuroscience. 35 (11), 1672-1683 (2012).
- Xapelli, S., et al. Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).
- Ribeiro-Resende, V. T., et al. Mice lacking GD3 synthase display morphological abnormalities in the sciatic nerve and neuronal disturbances during peripheral nerve regeneration. PLoS One. 9 (10), 108919 (2014).
- Xapelli, S., et al. Activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R) promotes neurogenesis in murine subventricular zone cell cultures. PLoS One. 8 (5), 63529 (2013).
- Kubrusly, R. C. C., et al. Neuro-glial cannabinoid receptors modulate signaling in the embryonic avian retina. Neurochemistry International. 112, 27-37 (2018).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. Journal of Neuroscience. 24 (13), 3413-3420 (2004).
- Illes, P. P2X7 Receptors Amplify CNS Damage in Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).
- Faroni, A., et al. Purinergic signaling mediated by P2X7 receptors controls myelination in sciatic nerves. Journal of Neuroscience Research. 92 (10), 1259-1269 (2014).
- Freitas, H. R., et al. Cannabinoids Induce Cell Death and Promote P2X7 Receptor Signaling in Retinal Glial Progenitors in Culture. Molecular Neurobiology. 56 (9), 6472-6486 (2019).
- Freitas, H. R., et al. Glutathione-Induced Calcium Shifts in Chick Retinal Glial Cells. PLoS One. 11 (4), 0153677 (2016).
- Yang, X. L. Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal neurons. Progress in Neurobiology. 73 (2), 127-150 (2004).
- Reis, R. A., Kubrusly, R. C., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Transient coupling of NMDA receptor with ip3 production in cultured cells of the avian retina. Neurochemistry International. 26 (4), 375-380 (1995).
- López-Colomé, A. M., Ortega, A., Romo-de-Vivar, M. Excitatory amino acid-induced phosphoinositide hydrolysis in Müller glia. Glia. 9 (2), 127-135 (1993).
- Ventura, A. L., de Mello, F. G., de Melo Reis, R. A. Methods of dopamine research in retina cells. Methods in Molecular Biology. 964, 25-42 (2013).
- Miras-Portugal, M. T., Sebastián-Serrano, &. #. 1. 9. 3. ;., de Diego García, L., Díaz-Hernández, M. Neuronal P2X7 Receptor: Involvement in Neuronal Physiology and Pathology. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7063-7072 (2017).
- Illes, P., Khan, T. M., Rubini, P. Neuronal P2X7 Receptors Revisited: Do They Really Exist. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7049-7062 (2017).
- Schitine, C. S., et al. Functional plasticity of GAT-3 in avian Müller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input. Neurochemistry International. 82, 42-51 (2015).
- Ferreira, D. D., Stutz, B., de Mello, F. G., Reis, R. A., Kubrusly, R. C. Caffeine potentiates the release of GABA mediated by NMDA receptor activation: Involvement of A1 adenosine receptors. Neurociência. 281, 208-215 (2014).
- Faria, R. X., Freitas, H. R., Reis, R. A. M. P2X7 receptor large pore signaling in avian Müller glial cells. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 215-229 (2017).
- Passos, A., et al. Regulation of the Serotonergic System by Kainate in the Avian Retina. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 1039-1049 (2019).
- de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L., Schitine, C. S., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors. Neurochemical Research. 33 (8), 1466-1474 (2008).
- Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers in Neuroscience. 9, 499. 9, 499 (2015).
