Modelagem da Hemorragia Intraventricular Neonatal Através da Injeção Intraventricular de Hemoglobina

Summary

Apresentamos um modelo de hemorragia intraventricular neonatal utilizando filhotes de ratos que mimetiza a patologia observada em humanos.

Abstract

A hemorragia intraventricular neonatal (IVH) é uma consequência comum do parto prematuro e leva a lesão cerebral, hidrocefalia pós-hemorrágica (HPH) e déficits neurológicos ao longo da vida. Embora a PHH possa ser tratada por procedimentos de desvio temporários e permanentes do líquido cefalorraquidiano (LCR) (reservatório ventricular e shunt ventriculoperitoneal, respectivamente), não há estratégias farmacológicas para prevenir ou tratar lesão cerebral induzida por IV e hidrocefalia. Modelos animais são necessários para entender melhor a fisiopatologia da IVH e testar tratamentos farmacológicos. Embora existam modelos existentes de HVI neonatal, aqueles que resultam de forma confiável em hidrocefalia são frequentemente limitados pela necessidade de injeções de grande volume, o que pode complicar a modelagem da patologia ou introduzir variabilidade no fenótipo clínico observado.

Estudos clínicos recentes implicaram hemoglobina e ferritina na causa de aumento ventricular após IVH. Aqui, desenvolvemos um modelo animal simples que imita o fenótipo clínico da PHH utilizando injeções intraventriculares de pequeno volume do produto de degradação do sangue hemoglobina. Além de induzir de forma confiável o aumento ventricular e a hidrocefalia, esse modelo resulta em lesão da substância branca, inflamação e infiltração de células imunes nas regiões periventricular e da substância branca. Este trabalho descreve este método clinicamente relevante e simples para modelar a HPH-IV em ratos neonatais usando injeção intraventricular e apresenta métodos para quantificar o tamanho do ventrículo após a injeção.

Introduction

A IVH neonatal origina-se da matriz germinativa, um local de rápida divisão celular adjacente aos ventrículos laterais do cérebro em desenvolvimento. Essa estrutura altamente vascular é vulnerável à instabilidade hemodinâmica relacionada ao parto prematuro. O sangue é liberado nos ventrículos laterais na hemorragia da matriz germinativa (GMH)-IVH quando os vasos sanguíneos frágeis dentro da matriz germinativa se rompem. No caso da IV IV de grau IV, o infarto hemorrágico periventricular também pode contribuir para a liberação de hemoderivados dentro do cérebro. ¹ A combinação de GMH-IVH pode causar HPH, particularmente após hemorragia de alto grau (graus III e IV)¹. A HPH pode ser tratada com a colocação de um shunt ventriculoperitoneal, mas a colocação do shunt não reverte a lesão cerebral que pode ocorrer a partir da IVH. Embora a terapia intensiva neonatal moderna tenha reduzido as taxas de IVH², ^3, não há tratamentos específicos para a lesão cerebral ou hidrocefalia causada pela IVH uma vez que tenha ocorrido. Uma limitação significativa no desenvolvimento de tratamentos preventivos para lesão cerebral induzida por HIV e HPH é a compreensão incompleta da fisiopatologia da HIV.

Recentemente, os níveis iniciais do LCR de hemoglobina de produto chave de degradação do sangue demonstraram estar associados ao desenvolvimento posterior de PHH em neonatos com IVH de alto grau⁴. Além disso, os níveis de proteínas da via de manipulação de ferro no LCR – hemoglobina, ferritina e bilirrubina – estão associados ao tamanho do ventrículo na IVH neonatal. Isso também foi demonstrado em uma coorte multicêntrica de lactentes com HPH pré-termo, onde níveis mais elevados de ferritina no LCR ventricular foram associados a um tamanho maior do ventrículo⁵.

Neste estudo, desenvolvemos um modelo clinicamente relevante de lesão cerebral induzida por IV e hidrocefalia utilizando injeção de hemoglobina nos ventrículos cerebrais, que permite quantificar a lesão cerebral e a HPH e testar novas estratégias terapêuticas (Figura 1)^{6, 7}. Este modelo IVH utiliza filhotes de ratos neonatais, que são colocados sob anestesia geral durante o procedimento. Uma incisão na linha média é feita no couro cabeludo, e coordenadas derivadas de marcos do crânio – o bregma ou lambda – são usadas para atingir os ventrículos laterais para injeção. A injeção lenta usando uma bomba de infusão fornece hemoglobina no ventrículo. Este protocolo é fácil de usar, versátil e pode modelar diferentes componentes da IVH que resultam em PHH.

Protocol

NOTA: Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais das instituições. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes, equipamentos e softwares usados neste protocolo. 1. Preparação de soluções de hemoglobina e LCR Preparar uma solução estéril de LCR artificial (aCSF) adicionando 500 μL da solução de aCSF a um microtubo de 1,5 ml e conservar em gelo. <l…

Representative Results

O sucesso da injeção foi confirmado por meios radiológicos e imuno-histoquímicos. Os animais submetidos à injeção de hemoglobina desenvolveram ventriculomegalia aguda moderada quando avaliados por RM (Figura 2A), com ventrículos laterais significativamente maiores às 24 h e 72 h após a injeção de hemoglobina em comparação aos animais injetados no LCR (Figura 2B,C). Embora não tenha havido diferença significativa no volume do vent…

Discussion

Este modelo de IVH utilizando injeção de hemoglobina permite o estudo da patologia da IVH especificamente mediada pela hemoglobina. Para estudos complementares, a hemoglobina também pode ser facilmente administrada in vitro e não confunde ensaios bioquímicos para proteínas produzidas por micróglias / macrófagos que estão presentes no sangue total.

As principais teorias da HIF-IV incluem a obstrução mecânica da circulação do LCR, a ruptura dos cílios que revestem as pare…

Materials

0.3 mL insulin syringe	BD Microfine + Insulin Syringe	230-4533	0.3-0.5 mL synringes will work
1.5 mL microtube	USA Scientific	1615-5500	Lot No. K194642H -3 511
4.7T MRI	Agilent/Varian	4.7T/33 cm	Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system
6-0 monofilament suture	ETHICON	667G
9.4T MRI	Bruker	BioSpec 94/20	Used in this protocol without the cryoprobe
Analytical balance	CCURIS Instruments	W3200-320
Artificial CSF (aCSF)	Tocris Bioscience	3525	Batch No: 72A
Betadine	Purdue Products L.P.	301005-00	NDC 67618-150-09
Carprofen (injectable)	Zoetis Inc.	PI 4019448	Rimadyl
Ethanol	Decon Laboratories	2701
Heating pad	Sunbeam	E12107-819	UL 612A, Z-1228-001
Hemoglobin	MP Biomedicals	100714	LOT NO. SR02321
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Isoflurane vaporizer	VETEQUIP	911103
Light for stereotactic insturment	Dolan-Jenner industries	Fiber-Lite MI-150
Microinjection syringe pump	World Precision Instruments	MICRO21	Serial 184034 T08K
MRI software	Bruker BioSpin	Paravision 360 3.2
Oxygen	Airgas Healthcare	UN1072	LOT NUMBER S1432080XA02
Sprague Dawley rats	Charles River Laboratories	Strain code: 001
Stereotactic instrument	KOPF Instuments	Model 900LS Lazy Susan
Sterile cotton tipped applicator	Fischerbrand	23-400-118
Surgical blade	covetrus	#10
Topical triple antibiotic	Triple Antibiotic Ointment	NDC 51672-2120-1
Ventricle volume quantification software	ITK-SNAP	ITK-SNAP 4.0.0 beta