Моделирование внутрижелудочкового кровоизлияния новорожденных посредством внутрижелудочковой инъекции гемоглобина
Summary
Представлена модель внутрижелудочкового кровоизлияния новорожденных с использованием крысиных детенышей, имитирующая патологию, наблюдаемую у человека.
Abstract
Неонатальное внутрижелудочковое кровоизлияние (IVH) является распространенным последствием преждевременных родов и приводит к черепно-мозговой травме, постгеморрагической гидроцефалии (PHH) и пожизненному неврологическому дефициту. В то время как PHH можно лечить с помощью временных и постоянных процедур отвода спинномозговой жидкости (CSF) (желудочковый резервуар и вентрикулоперитонеальный шунт, соответственно), нет фармакологических стратегий для профилактики или лечения IVH-индуцированной черепно-мозговой травмы и гидроцефалии. Животные модели необходимы для лучшего понимания патофизиологии IVH и тестирования фармакологических методов лечения. В то время как существуют модели неонатального IVH, те, которые надежно приводят к гидроцефалии, часто ограничены необходимостью инъекций большого объема, что может усложнить моделирование патологии или внести вариабельность в наблюдаемый клинический фенотип.
Недавние клинические исследования показали, что гемоглобин и ферритин вызывают увеличение желудочков после IVH. Здесь мы разрабатываем простую животную модель, которая имитирует клинический фенотип PHH, используя внутрижелудочковые инъекции продукта распада крови гемоглобина. В дополнение к надежному индуцированию увеличения желудочков и гидроцефалии, эта модель приводит к повреждению белого вещества, воспалению и инфильтрации иммунных клеток в перивентрикулярных и белых областях. В этой статье описывается этот клинически значимый, простой метод моделирования IVH-PHH у неонатальных крыс с использованием внутрижелудочковой инъекции и представлены методы количественной оценки размера желудочка после инъекции.
Introduction
Неонатальный IVH происходит из зародышевого матрикса, места быстрого деления клеток, которое примыкает к боковым желудочкам развивающегося мозга. Эта высокососудистая структура уязвима к гемодинамической нестабильности, связанной с преждевременными родами. Кровь высвобождается в боковые желудочки при кровоизлиянии в зародышевый матрикс (GMH)-IVH при разрыве хрупких кровеносных сосудов внутри зародышевого матрикса. В случае IVH IV степени перивентрикулярный геморрагический инфаркт также может способствовать высвобождению продуктов крови в головном мозге. 1 Комбинация GMH-IVH может вызвать PHH, особенно после полноценного кровоизлияния (степени III и IV)1. PHH можно лечить с помощью размещения вентрикулоперитонеального шунта, но размещение шунта не обращает вспять черепно-мозговую травму, которая может возникнуть от IVH. Хотя современная неонатальная интенсивная терапия снизила показатели IVH2, 3, нет никаких конкретных методов лечения черепно-мозговой травмы или гидроцефалии, вызванной IVH после того, как это произошло. Существенным ограничением в разработке профилактических методов лечения травм головного мозга, вызванных IVH, и PHH является неполное понимание патофизиологии IVH.
Недавно было показано, что ранние уровни ликвора ключевого продукта распада крови гемоглобина связаны с более поздним развитием ПГ у новорожденных с высокосортным IVH4. Кроме того, уровни ликвора белков пути обработки железа — гемоглобина, ферритина и билирубина — связаны с размером желудочков в неонатальном IVH. Это также было показано в многоцентровой когорте младенцев с недоношенным PHH, где более высокие уровни ферритина в желудочковом ликворе были связаны с большим размером желудочка5.
В этом исследовании мы разработали клинически значимую модель ivH-индуцированной черепно-мозговой травмы и гидроцефалии с использованием инъекции гемоглобина в желудочки головного мозга, которая позволяет количественно оценить черепно-мозговую травму и PHH и протестировать новые терапевтические стратегии (рисунок 1)6, 7. Эта модель IVH использует детенышей неонатальных крыс, которые помещаются под общую анестезию на время процедуры. Разрез средней линии делается на коже головы, а координаты, полученные из ориентиров черепа — брегма или лямбда — используются для нацеливания на боковые желудочки для инъекции. Медленная инъекция с использованием инфузионного насоса доставляет гемоглобин в желудочек. Этот протокол прост в использовании, универсален и может моделировать различные компоненты IVH, которые приводят к PHH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта модель IVH с использованием инъекций гемоглобина позволяет изучать патологию IVH, специфически опосредованную гемоглобином. Для дополнительных исследований гемоглобин также может быть легко доставлен in vitro и не мешает биохимическим анализам белков, полученных микроглией / макр…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JMS получила финансирование от NIH/NINDS R01 NS110793 и K12 (Neurosurgion Research Career Development Program). BAM получил финансирование от NIH / NINDS K08 NS112580-01A1, University of Kentucky Neuroscience Research Priority Area Award и Hydrocephalus Association Innovator Award.
Materials
| 0.3 mL insulin syringe | BD Microfine + Insulin Syringe | 230-4533 | 0.3-0.5 mL synringes will work |
| 1.5 mL microtube | USA Scientific | 1615-5500 | Lot No. K194642H -3 511 |
| 4.7T MRI | Agilent/Varian | 4.7T/33 cm | Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system |
| 6-0 monofilament suture | ETHICON | 667G | |
| 9.4T MRI | Bruker | BioSpec 94/20 | Used in this protocol without the cryoprobe |
| Analytical balance | CCURIS Instruments | W3200-320 | |
| Artificial CSF (aCSF) | Tocris Bioscience | 3525 | Batch No: 72A |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 301005-00 | NDC 67618-150-09 |
| Carprofen (injectable) | Zoetis Inc. | PI 4019448 | Rimadyl |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-819 | UL 612A, Z-1228-001 |
| Hemoglobin | MP Biomedicals | 100714 | LOT NO. SR02321 |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isoflurane vaporizer | VETEQUIP | 911103 | |
| Light for stereotactic insturment | Dolan-Jenner industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | MICRO21 | Serial 184034 T08K |
| MRI software | Bruker BioSpin | Paravision 360 3.2 | |
| Oxygen | Airgas Healthcare | UN1072 | LOT NUMBER S1432080XA02 |
| Sprague Dawley rats | Charles River Laboratories | Strain code: 001 | |
| Stereotactic instrument | KOPF Instuments | Model 900LS Lazy Susan | |
| Sterile cotton tipped applicator | Fischerbrand | 23-400-118 | |
| Surgical blade | covetrus | #10 | |
| Topical triple antibiotic | Triple Antibiotic Ointment | NDC 51672-2120-1 | |
| Ventricle volume quantification software | ITK-SNAP | ITK-SNAP 4.0.0 beta |
Referências
- Robinson, S. Neonatal posthemorrhagic hydrocephalus from prematurity: Pathophysiology and current treatment concepts: A review. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 9 (3), (2012).
- Hasselager, A. B., Børch, K., Pryds, O. A. Improvement in perinatal care for extremely premature infants in Denmark from. Danish Medical Journal. 63 (1), (1994).
- Johnston, P. G., Gillam-Krakauer, M., Fuller, M. P., Reese, J. Evidence-Based Use of Indomethacin and Ibuprofen in the Neonatal Intensive Care Unit. Clinics in Perinatology. 39 (1), (2012).
- Mahaney, K. B., Buddhala, C., Paturu, M., Morales, D., Limbrick, D. D., Strahle, J. M. Intraventricular Hemorrhage Clearance in Human Neonatal Cerebrospinal Fluid: Associations with Hydrocephalus. Stroke. , (2020).
- Strahle, J. M., et al. Longitudinal CSF Iron Pathway Proteins in Posthemorrhagic Hydrocephalus: Associations with Ventricle Size and Neurodevelopmental Outcomes. Annals of Neurology. 90 (2), (2021).
- Strahle, J. M., et al. Role of Hemoglobin and Iron in hydrocephalus after neonatal intraventricular hemorrhage. Neurosurgery. 75 (6), (2014).
- Garton, T. P., He, Y., Garton, H. J. L., Keep, R. F., Xi, G., Strahle, J. M. Hemoglobin-induced neuronal degeneration in the hippocampus after neonatal intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1635, (2016).
- Goulding, D. S., Caleb Vogel, ., Gensel, R., Morganti, J. C., Stromberg, J. M., Miller, A. J., A, B. Acute brain inflammation, white matter oxidative stress, and myelin deficiency in a model of neonatal intraventricular hemorrhage. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 26 (6), (2020).
- Strahle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K. M., Keep, R. F., Xi, G. Mechanisms of Hydrocephalus After Neonatal and Adult Intraventricular Hemorrhage. Translational Stroke Research. 3, (2012).
- Jinnai, M., et al. A Model of Germinal Matrix Hemorrhage in Preterm Rat Pups. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).
- Georgiadis, P., et al. Characterization of acute brain injuries and neurobehavioral profiles in a rabbit model of germinal matrix hemorrhage. Stroke. 39 (12), (2008).
- Cherian, S. S., Love, S., Silver, I. A., Porter, H. J., Whitelaw, A. G. L., Thoresen, M. Posthemorrhagic ventricular dilation in the neonate: Development and characterization of a rat model. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 62 (3), (2003).
- Balasubramaniam, J., Xue, M., Buist, R. J., Ivanco, T. L., Natuik, S., del Bigio, ., R, M. Persistent motor deficit following infusion of autologous blood into the periventricular region of neonatal rats. Experimental Neurology. (1), (2006).
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances. The Lancet Neurology. 8 (1), (2009).
- Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), (1979).
- Craig, A., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Experimental Neurology. 181 (2), (2003).
- Lodygensky, G. A., Vasung, L., Sv Sizonenko, ., Hüppi, P. S. Neuroimaging of cortical development and brain connectivity in human newborns and animal models. Journal of Anatomy. 217 (4), (2010).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (34), (2011).
- Engelhardt, B. Development of the blood-brain barrier. Cell and Tissue Research. 314 (1), (2003).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for bloodĝ€"brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), (2010).
- Alles, Y. C. J., Greggio, S., Alles, R. M., Azevedo, P. N., Xavier, L. L., DaCosta, J. C. A novel preclinical rodent model of collagenase-induced germinal matrix/intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1356, (2010).
- Christian, E. A., et al. Trends in hospitalization of preterm infants with intraventricular hemorrhage and hydrocephalus in the United States. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 17 (3), 2000-2010 (2016).
