Kvantifisering av subcellulær glykogenfordeling i skjelettmuskulaturfibre ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi

Summary

En modifisert post-fiksering prosedyre øker kontrasten av glykogen partikler i vev. Dette dokumentet gir en trinnvis protokoll som beskriver hvordan man håndterer vevet, utfører avbildningen og bruker stereologiske metoder for å oppnå objektive og kvantitative data om fibertypespesifikk subcellulær glykogenfordeling i skjelettmuskulatur.

Abstract

Ved bruk av transmisjonselektronmikroskopi kan det oppnås høyoppløselige bilder av faste prøver som inneholder individuelle muskelfibre. Dette muliggjør kvantifisering av ultrastrukturelle aspekter som volumfraksjoner, overflateareal til volumforhold, morformetri og fysiske kontaktområder for forskjellige subcellulære strukturer. På 1970-tallet ble en protokoll for forbedret farging av glykogen i celler utviklet og banet vei for en rekke studier på subcellulær lokalisering av glykogen og glykogenpartikkelstørrelse ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi. Mens de fleste analyser tolker glykogen som om det er homogent fordelt i muskelfibrene, og bare gir en enkelt verdi (f.eks. en gjennomsnittlig konsentrasjon), har transmisjonselektronmikroskopi avslørt at glykogen lagres som diskrete glykogenpartikler plassert i forskjellige subcellulære rom. Her beskrives den trinnvise protokollen fra vevsinnsamling til kvantitativ bestemmelse av volumfraksjonen og partikkeldiameteren til glykogen i de distinkte subcellulære rommene til individuelle skjelettmuskulaturfibre. Hensyn til hvordan man samler inn og flekker vevsprøver, 2) utfører bildeanalyser og datahåndtering, 3) evaluerer presisjonen av estimater, 4) diskriminerer mellom muskelfibertyper, og 5) metodologiske fallgruver og begrensninger er inkludert.

Introduction

Glykogenpartikler består av forgrenede polymerer av glukose og ulike tilknyttede ^proteiner1 og utgjør et viktig drivstoff under høye metabolske ^krav2. Selv om det ikke er allment anerkjent, utgjør glykogenpartikler også et lokalt drivstoff, hvor noen subcellulære prosesser fortrinnsvis bruker glykogen til tross for tilgjengeligheten av andre og mer langvarige drivstoff som plasmaglukose og ^fettsyrer3,4.

Betydningen av å lagre glykogen som et subcellulært spesifikt lokalisert drivstoff har blitt diskutert i flere ^{vurderinger5,6} hovedsakelig basert på noen av de tidligste dokumentasjonene av den subcellulære fordelingen av glykogen ved overføringselektronmikroskopi (TEM)^7,8. De første studiene brukte forskjellige protokoller for å øke kontrasten til glykogen fra histokjemiske fargingsteknikker til negative og positive ^flekker9,10. En viktig metodologisk utvikling var den raffinerte postfikseringsprotokollen med kaliumferrocyanid-redusert osmium11,12,13,14, noe som forbedret kontrasten til glykogenpartikler betydelig. Denne raffinerte protokollen ble ikke brukt i noe av det banebrytende arbeidet med treningsindusert glykogenuttømming15, men ble gjeninnført av Graham og ^{kolleger16,17}.

Basert på de 2-dimensjonale bildene, er den subcellulære fordelingen av glykogen oftest beskrevet som glykogenpartikler som ligger i tre bassenger: subsarcolemmal (like under overflatemembranen), intermyofibrillar (mellom myofibrils) eller intramyofibrillar (innenfor myofibrilene). Glykogenpartikler kan imidlertid også beskrives som assosiert med for eksempel sarkoplasmatisk retikulum7 eller ^kjerner18. I tillegg til den subcellulære fordelingen er fordelen med TEM-estimert glykogeninnhold også at kvantifisering kan utføres på enkeltfibernivå. Dette gjør det mulig å undersøke fiber-til-fiber variasjon og korrelative analyser med fibertyper og cellulære komponenter som mitokondrier og lipiddråper.

Her er protokollen for TEM-estimert fibertypespesifikk volumetrisk innhold av de tre vanlige subcellulære bassengene av glykogen (subsarcolemmal, intermyofibrillar og intramyofibrillar) i skjelettmuskulaturfibre beskrevet. Metoden har blitt brukt på skjelettmuskler fra ^mennesker19, ^rotter20 og ^mus21; så vel som fugler og ^fisk22; kardiomyocytter fra ^rotter23.

Protocol

Dagens protokoll med humane biopsied skjelettmuskulaturprøver ble godkjent av Regionale komiteer for helseforskningsetikk for Sør-Danmark (S-20170198). Muskelbiopsier ble oppnådd gjennom et snitt i huden fra den enorme lateralismuskelen ved hjelp av en Bergström nål med sug etter at lokalbedøvelse ble gitt subkutant (1-3 ml Lidokain 2% per snitt). Hvis isolerte hele rottemuskler ble brukt, ble dyrene ofret av cervical dislokasjon før muskelbiopsiene ble oppnådd, i samsvar med retningslinjene fra dyreetik…

Representative Results

Ved hjelp av denne protokollen fremstår glykogenpartikler som svarte og distinkte (figur 1 og figur 2). De normale verdiene av glykogen er avbildet i figur 3. Disse dataene er basert på totalt 362 fibre fra 41 friske unge menn som samlet inn i forskjellige tidligere studier19,24,29,30,31.<sup …

Discussion

Det kritiske trinnet i metoden er bruk av redusert osmium ved kaliumferrocyanid under etterfiksering. Selektiviteten til dette modifiserte fikseringsmiddelet for glykogendeteksjon kan ikke forklares fullt ut av kjemi, men inkluderer også eksperimentelle funn som ikke viser noen deteksjon av slike partikler i vev som er kjent for å være fri for glykogen eller i det ekstracellulære ^rommet11.

Kritiske parametere er presisjonen til estimatene og fiber-til-fiber-variasjo…

Materials

1,2-Propylene oxide	Merck	75-56-9
Embedding 812 resin medium kit	Taab	T031
Glutaraldehyde solution 25%	Merck	1.04239.0250
ITEM	Olympus		Imaging software
Leica EM AC20	Leica		Automatic contrasting system
OSIS Veleta digital camera	Olympus
Osmium tetroxide 4% solution	Polysciences	0972A
Philips CM 100 Transmission EM	Philips
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate	Sigma-Aldrich	455989-245G
Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4	Ampliqon.com	AMPQ40989.0500
Ultra-microtome Leica UC7	Leica
Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution	Leica	16707235
Uranyl acetate dihydrate	Polysciences	6159-44-0