Quantificação da Distribuição de Glicogênio Subcelular em Fibras Musculares Esqueléticas usando Microscopia eletrônica de transmissão

Summary

Um procedimento pós-fixação modificado aumenta o contraste das partículas de glicogênio no tecido. Este artigo fornece um protocolo passo-a-passo descrevendo como lidar com o tecido, conduzir a imagem e usar métodos esterológicos para obter dados imparciales e quantitativos sobre a distribuição de glicogênio subcelular específico do tipo de fibra no músculo esquelético.

Abstract

Com o uso de microscopia eletrônica de transmissão, podem ser obtidas imagens de alta resolução de amostras fixas contendo fibras musculares individuais. Isso permite quantificações de aspectos ultraestruturais, como frações de volume, proporções de superfície/volume, morfometria e locais de contato físico de diferentes estruturas subcelulares. Na década de 1970, um protocolo para melhor coloração de glicogênio nas células foi desenvolvido e abriu caminho para uma série de estudos sobre a localização subcelular do tamanho de partículas glicogênio e glicogênio usando microscopia eletrônica de transmissão. Enquanto a maioria das análises interpreta o glicogênio como se fosse distribuído homogêneo dentro das fibras musculares, fornecendo apenas um único valor (por exemplo, uma concentração média), a microscopia eletrônica de transmissão revelou que o glicogênio é armazenado como partículas de glicogênio discretas localizadas em compartimentos subcelulares distintos. Aqui, descreve-se o protocolo passo-a-passo da coleta de tecidos para a determinação quantitativa da fração de volume e diâmetro de partículas do glicogênio nos distintos compartimentos subcelulares das fibras musculares esqueléticas individuais. Considerações sobre como 1) coletar e manchar amostras de tecidos, 2) realizar análises de imagem e manuseio de dados, 3) avaliar a precisão das estimativas, 4) discriminar entre tipos de fibras musculares e 5) armadilhas e limitações metodológicas.

Introduction

As partículas glicogênio são compostas de polímeros ramificados de glicose e várias proteínas ^associadas1 e constituem um combustível importante durante altas demandas metabólicas2. Embora não amplamente reconhecidas, as partículas de glicogênio também constituem um combustível local, onde alguns processos subcelulares utilizam preferencialmente o glicogênio, apesar da disponibilidade de outros combustíveis mais duradouros como glicose plasmática e ácidos ^graxos3,4.

A importância de armazenar glicogênio como combustível localizado específico subcelular tem sido discutida em várias ^revisões5,6 principalmente com base em algumas das documentações mais antigas da distribuição subcelular de glicogênio por microscopia eletrônica de transmissão (TEM)^7,8. Os primeiros estudos utilizaram diferentes protocolos para aumentar o contraste do glicogênio das técnicas histoquímicas de coloração para manchas negativas e ^{positivas9,10}. Um importante desenvolvimento metodológico foi o refinado protocolo pós-fixação com o osmium reduzido por ferrociancida de ^{potássio111,12,13,14}, o que melhorou significativamente o contraste das partículas de glicogênio. Este protocolo refinado não foi usado em alguns dos trabalhos pioneiros sobre o esgotamento do glicogênio induzido pelo ^exercício15, mas foi reintroduzido por Graham e seus ^colegas16,17.

Com base nas imagens bidimensionais, a distribuição subcelular do glicogênio é mais frequentemente descrita como partículas de glicogênio localizadas em três piscinas: subsarcolemmal (logo abaixo da membrana superficial), intermyofibrilar (entre os miofibrils) ou intramyofibrilar (dentro dos miofibrils). No entanto, partículas de glicogênio também podem ser descritas como associadas, por exemplo, a reguloso sarcoplasmático7 ou ^núcleos18. Além da distribuição subcelular, a vantagem do teor de glicogênio estimado pelo TEM também é que a quantificação pode ser realizada no nível único de fibra. Isso permite a investigação da variabilidade de fibra para fibra e análises correlativas com tipos de fibras e componentes celulares como mitocôndrias e gotículas lipídicas.

Aqui, descreve-se o protocolo para o teor volutrico específico do tipo de fibra tem das três piscinas subcelulares comuns de glicogênio (subsarcolemmal, intermyofibrilar e intramyofibrilar) em fibras musculares esqueléticas. O método foi aplicado aos músculos esqueléticos de ^humanos19, ^ratos20 e camundongos21; assim como aves e ^peixes22; e cardiomiócitos de ^ratos23.

Protocol

O presente protocolo utilizando amostras de músculo esquelético biopsied humano foi aprovado pelos Comitês Regionais de Ética em Pesquisa em Saúde para a Dinamarca do Sul (S-20170198). Biópsias musculares foram obtidas através de uma incisão na pele do músculo vasto lateralis usando uma agulha bergström com sucção após a anestesia local ter sido dada subcutânea (1-3 mL de Lidocaína 2% por incisão). Se utilizados músculos inteiros de ratos isolados, os animais foram sacrificados por luxação cer…

Representative Results

Usando este protocolo, as partículas de glicogênio parecem negras e distintas (Figuras 1 e Figura 2). Os valores normais do glicogênio são retratados na Figura 3. Esses dados são baseados em um total de 362 fibras de 41 jovens saudáveis, conforme coletado em diferentes estudos anteriores19,24,29,30,31.</su…

Discussion

A etapa crítica do método é o uso de osmium reduzido por ferrocianídeo de potássio durante a pós-fixação. A seletividade deste fixador modificado para detecção de glicogênio não pode ser totalmente explicada pela química, mas também inclui achados experimentais que demonstram nenhuma detecção de tais partículas em tecidos conhecidos por estarem livres de glicogênio ou no espaço ^{extracelular11}.

Parâmetros críticos são a precisão das estimativas e a…

Materials

1,2-Propylene oxide	Merck	75-56-9
Embedding 812 resin medium kit	Taab	T031
Glutaraldehyde solution 25%	Merck	1.04239.0250
ITEM	Olympus		Imaging software
Leica EM AC20	Leica		Automatic contrasting system
OSIS Veleta digital camera	Olympus
Osmium tetroxide 4% solution	Polysciences	0972A
Philips CM 100 Transmission EM	Philips
Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate	Sigma-Aldrich	455989-245G
Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4	Ampliqon.com	AMPQ40989.0500
Ultra-microtome Leica UC7	Leica
Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution	Leica	16707235
Uranyl acetate dihydrate	Polysciences	6159-44-0