Isolering af rottefedtvæv Mesenkymale stamceller til differentiering i insulinproducerende celler

Summary

Fedtvævsafledte mesenkymale stamceller (Ad-MSC’er) kan være en potentiel kilde til MSC’er, der differentierer sig til insulinproducerende celler (IPC’er). I denne protokol giver vi detaljerede trin til isolering og karakterisering af rotte epididymal Ad-MSC’er efterfulgt af en enkel, kort protokol til generering af IPC’er fra de samme rotte-AD-MSC’er.

Abstract

Mesenkymale stamceller (MSC’er) – især dem, der er isoleret fra fedtvæv (Ad-MSC’er) – har fået særlig opmærksomhed som en vedvarende, rigelig kilde til stamceller, der ikke giver anledning til etiske bekymringer. Imidlertid er de nuværende metoder til at isolere Ad-MSC’er ikke standardiserede og anvender komplicerede protokoller, der kræver specielt udstyr. Vi isolerede Ad-MSC’er fra det epididymale fedt fra Sprague-Dawley-rotter ved hjælp af en enkel, reproducerbar metode. De isolerede Ad-MSC’er vises normalt inden for 3 dage efter isolering, da vedhængende celler viser fibroblastisk morfologi. Disse celler når 80% sammenløb inden for 1 uge efter isolation. Derefter blev der ved passage 3-5 (P3-5) udført en fuld karakterisering for de isolerede Ad-MSC’er ved immunophenotypning for karakteristisk MSC-klynge af differentieringsoverflademarkører (CD90, CD73 og CD105) samt inducering af differentiering af disse celler ned ad de osteogene, adipogene og kondrogogene afstamninger. Dette indebærer igen multipotensen af de isolerede celler. Desuden inducerede vi differentieringen af de isolerede Ad-MSC’er mod de insulinproducerende celler (IPC’er) afstamning via en simpel, relativt kort protokol ved at inkorporere Højglukose Dulbeccos modificerede Eagle-medium (HG-DMEM), β-mercaptoethanol, nicotinamid og exendin-4. IPC’ers differentiering blev genetisk vurderet, for det første ved at måle ekspressionsniveauer for specifikke β-cellemarkører såsom MafA, NKX6.1, Pdx-1 og Ins1 samt dithizonefarvning for de genererede IPC’er. For det andet blev vurderingen også udført funktionelt ved et glukosestimuleret insulinsekretionsassay (GSIS). Afslutningsvis kan Ad-MSC’er let isoleres og udviser alle MSC-karakteriseringskriterier, og de kan faktisk give en rigelig, vedvarende kilde til IPC’er i laboratoriet til diabetesforskning.

Introduction

Mesenkymale stamceller (MSC’er), også kendt som mesenkymale stromale celler, er blandt de mest anvendte celletyper til regenerativ medicin ^1,2. De er klassificeret som voksne stamceller og karakteriseret ved multilineage differentieringspotentiale og selvfornyelseskapacitet³. MSC’er kan isoleres og fås fra forskellige kilder, herunder fedtvæv, knoglemarv, perifert blod, navlesnorsvæv og blod, hårsække og tænder ^4,5.

Isoleringen af stamceller fra fedtvæv ses som både tiltalende og lovende på grund af deres lette adgang, hurtige ekspansion in vitro og høje udbytte⁶. Fedtvævsafledte mesenkymale stamceller (Ad-MSC’er) kan isoleres fra forskellige arter såsom mennesker, kvæg, mus, rotter og for nylig geder⁷. Det er bevist, at ad-MSC’er nu er potentielle kandidater til vævsteknik og gen-/celleterapi, som endda kan bruges til at udvikle et autologt alternativ til langsigtet reparation af bløddelsskader eller -defekter ^7,8.

International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) har defineret tre minimumskriterier, der skal udvises af MSC’er for fuld karakterisering⁹. For det første skal de være plastiske tilhængere. For det andet bør MSC’er udtrykke mesenkymale stamcelleoverflademarkører såsom CD73, CD90 og CD105 og manglende ekspression af de hæmatopoietiske markører CD45, CD34, CD14 eller CD11b, CD79α eller CD19 og HLA-DR. Endelig bør MSC’er udvise evnen til at differentiere sig i de tre mesenkymale afstamninger: adipocytter, osteocytter og kondrocytter. Interessant nok kan MSC’er også differentiere sig til andre slægter såsom neuronale celler, kardiomyocytter, hepatocytter og epitelceller^10,11.

Faktisk har MSC’er unikke egenskaber, der gør det muligt at anvende dem som potentielle terapeutiske midler i regenerativ terapi til forskellige sygdomme. MSC’er kan udskille opløselige faktorer for at inducere et immunmodulerende miljø, der giver terapeutiske fordele¹². Derudover kan MSC’er migrere mod skadesteder og tumormikromiljøer for at levere målrettet terapi; Mekanismerne er dog ikke fuldt belyst¹³. Derudover har MSC’er evnen til at udskille exosomer, ekstracellulære vesikler i nanoskalaen, der bærer en last af ikke-kodende RNA’er, protein og opløselige faktorer, som for nylig opstod som en ny mekanisme for MSC’ernes terapeutiske potentiale i forskellige sygdomme¹⁴.

Endnu vigtigere har MSC’er skabt markant opmærksomhed for deres potentiale til at differentiere sig til insulinproducerende celler (IPC’er), enten ved genetisk modifikation^15,16 eller ved at udnytte forskellige ekstrinsisk inducerende faktorer inden for kulturmediet in vitro¹⁷. IPC-induktionsperioden varierer meget, da det afhænger af den anvendte induktionsprotokol og de anvendte ydre faktorer. Differentieringsprocessen kan vare fra dage til måneder, og det kræver en kombination af eksogene inducerende faktorer, der skal tilføjes og / eller trækkes tilbage i forskellige faser. Mange af disse faktorer, der er blevet anvendt til endokrin bugspytkirteldifferentiering, er biologisk aktive forbindelser, der har vist sig at fremme proliferation eller differentiering / neogenese af insulinudskillende β-celler og / eller øge insulinindholdet i IPC’er 18,19,20,21. Det er her bemærkelsesværdigt, at MSC’er også er blevet rapporteret at have terapeutiske virkninger i diabetes og dets komplikationer via flere mekanismer, herunder deres sekretom, samt en bred vifte af immunmodulerende handlinger 22,23,24.

I denne protokol præsenterer vi en detaljeret trinvis protokol til isolering og karakterisering af Ad-MSC’er fra rotte epididymalt fedt efterfulgt af en simpel, relativt kort protokol til generering af IPC’er fra Ad-MSC’er.

Protocol

Alle eksperimenter blev udført i henhold til de godkendte retningslinjer, og alle procedurer blev godkendt af det etiske udvalg for det farmaceutiske fakultet, Det Britiske Universitet i Egypten (BUE), Kairo, Egypten. Ad-MSC-isolationsprotokollen blev vedtaget af Lopez og Spencer med modifikationer15. 1. Isolering af Ad-MSC’er fra rotte epididymale fedtpuder Brug han Sprague-Dawley rotter, der vejer 250-300 g, der ikke er mere end 1 måned (t…

Representative Results

Isolering og karakterisering af ad-MSC’erSom vist i figur 2 viste de isolerede celler fra fedtvæv en heterogen population af afrundede og fibroblastlignende celler fra den næste isolationsdag (figur 2A). 4 dage efter isolation begyndte fibroblastcellerne at stige i antal og størrelse og vokse som en homogen population ved passage 1 (figur 2B, C). Disse celler fortsatte med at vokse som plastt…

Discussion

I denne protokol lykkedes det os at præsentere en detaljeret protokol for isolering af Ad-MSC’er fra rotte epididymalt fedt og differentieringen af disse Ad-MSC’er til IPC’er. Faktisk er rotteepydydmalt fedt en let opnåelig kilde til fedtvæv til opnåelse af Ad-MSC’er og kræver ikke noget specielt udstyr, hverken til indsamling eller til behandling af 15,26,27. De isolerede Ad-MSC’er viste fremragende kulturudvidelse og udvi…

Materials

Albumin, bovine serum Fraction V	MP Biomedicals
Alcian Blue 8GX	Sigma-Aldrich, USA	A3157
Alizarin Red S	Sigma-Aldrich, USA	A5533
Ammonium hydroxide	Fisher Scientific, Germany
Antibody for Rat CD90, FITC	Stem Cell Technologies	60024FI
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A3912
Calcium Chloride	Fisher Scientific, Germany
CD105 Monoclonal Antibody, FITC	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA	MA1-19594
CD34 Polyclonal Antibody	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA	PA5-85917
Chloroform	Fisher Scientific, USA
Collagenase type I, powder	Gibco, Thermo Fisher, USA	17018029
D-Glucose anhydrous, extra pure	Fisher Scientific, Germany	G/0450/53
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific, Germany	BP231-100
Dithizone staining	Sigma-Aldrich, USA	D5130
DMEM – High Glucose 4.5 g/L	Lonza, Switzerland	12-604F
DMEM – Low Glucose 1 g/L	Lonza, Switzerland	12-707F
DMEM/F12 medium	Lonza, Switzerland	BE12-719F
DNAse/RNAse free water	Gibco Thermo Fisher, USA	10977-035
Ethanol absolute, Molecular biology grade	Sigma-Aldrich, Germany	24103
Exendin-4	Sigma-Aldrich, Germany	E7144
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Thermo Fisher, Brazil	10270-106
Formaldehyde 37%	Fisher Scientific
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Scientific, Germany
Isopropanol, Molecular biology grade	Fisher Scientific, USA	BP2618500
L-Glutamine	Gibco Thermo Fisher, USA	25030-024
Magnesium Chloride (Anhydrous)	Fisher Scientific, Germany
Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit	R&D systems Inc., MN, USA	SC006
Nicotinamide	Sigma-Aldrich, Germany	N0636
Oil Red Stain	Sigma-Aldrich, USA	O0625
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin	Gibco Thermo Fisher, USA	15240062
Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg	Lonza, Switzerland	BE17-516F
Potassium Chloride	Fisher Scientific, Germany
Rat Insulin ELISA Kit	Cloud-Clone Corp., USA	CEA682Ra
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific, Germany
Sodium Chloride	Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous)	Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous)	Fisher Scientific, Germany
SYBR Green Maxima	Thermo Scientific, USA	K0221
Syringe filter, 0.2 micron	Corning, USA	431224
TRIzol	Thermo Scientific, USA	15596026
Trypan blue	Gibco Thermo Fisher, USA	15250061
Trypsin-Versene-EDTA, 1X	Lonza, Switzerland	CC-5012
Verso cDNA synthesis kit	Thermo Scientific, USA	AB-1453/A
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich, Germany	M3148