Fedtvævsafledte mesenkymale stamceller (Ad-MSC’er) kan være en potentiel kilde til MSC’er, der differentierer sig til insulinproducerende celler (IPC’er). I denne protokol giver vi detaljerede trin til isolering og karakterisering af rotte epididymal Ad-MSC’er efterfulgt af en enkel, kort protokol til generering af IPC’er fra de samme rotte-AD-MSC’er.
Mesenkymale stamceller (MSC’er) – især dem, der er isoleret fra fedtvæv (Ad-MSC’er) – har fået særlig opmærksomhed som en vedvarende, rigelig kilde til stamceller, der ikke giver anledning til etiske bekymringer. Imidlertid er de nuværende metoder til at isolere Ad-MSC’er ikke standardiserede og anvender komplicerede protokoller, der kræver specielt udstyr. Vi isolerede Ad-MSC’er fra det epididymale fedt fra Sprague-Dawley-rotter ved hjælp af en enkel, reproducerbar metode. De isolerede Ad-MSC’er vises normalt inden for 3 dage efter isolering, da vedhængende celler viser fibroblastisk morfologi. Disse celler når 80% sammenløb inden for 1 uge efter isolation. Derefter blev der ved passage 3-5 (P3-5) udført en fuld karakterisering for de isolerede Ad-MSC’er ved immunophenotypning for karakteristisk MSC-klynge af differentieringsoverflademarkører (CD90, CD73 og CD105) samt inducering af differentiering af disse celler ned ad de osteogene, adipogene og kondrogogene afstamninger. Dette indebærer igen multipotensen af de isolerede celler. Desuden inducerede vi differentieringen af de isolerede Ad-MSC’er mod de insulinproducerende celler (IPC’er) afstamning via en simpel, relativt kort protokol ved at inkorporere Højglukose Dulbeccos modificerede Eagle-medium (HG-DMEM), β-mercaptoethanol, nicotinamid og exendin-4. IPC’ers differentiering blev genetisk vurderet, for det første ved at måle ekspressionsniveauer for specifikke β-cellemarkører såsom MafA, NKX6.1, Pdx-1 og Ins1 samt dithizonefarvning for de genererede IPC’er. For det andet blev vurderingen også udført funktionelt ved et glukosestimuleret insulinsekretionsassay (GSIS). Afslutningsvis kan Ad-MSC’er let isoleres og udviser alle MSC-karakteriseringskriterier, og de kan faktisk give en rigelig, vedvarende kilde til IPC’er i laboratoriet til diabetesforskning.
Mesenkymale stamceller (MSC’er), også kendt som mesenkymale stromale celler, er blandt de mest anvendte celletyper til regenerativ medicin 1,2. De er klassificeret som voksne stamceller og karakteriseret ved multilineage differentieringspotentiale og selvfornyelseskapacitet3. MSC’er kan isoleres og fås fra forskellige kilder, herunder fedtvæv, knoglemarv, perifert blod, navlesnorsvæv og blod, hårsække og tænder 4,5.
Isoleringen af stamceller fra fedtvæv ses som både tiltalende og lovende på grund af deres lette adgang, hurtige ekspansion in vitro og høje udbytte6. Fedtvævsafledte mesenkymale stamceller (Ad-MSC’er) kan isoleres fra forskellige arter såsom mennesker, kvæg, mus, rotter og for nylig geder7. Det er bevist, at ad-MSC’er nu er potentielle kandidater til vævsteknik og gen-/celleterapi, som endda kan bruges til at udvikle et autologt alternativ til langsigtet reparation af bløddelsskader eller -defekter 7,8.
International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) har defineret tre minimumskriterier, der skal udvises af MSC’er for fuld karakterisering9. For det første skal de være plastiske tilhængere. For det andet bør MSC’er udtrykke mesenkymale stamcelleoverflademarkører såsom CD73, CD90 og CD105 og manglende ekspression af de hæmatopoietiske markører CD45, CD34, CD14 eller CD11b, CD79α eller CD19 og HLA-DR. Endelig bør MSC’er udvise evnen til at differentiere sig i de tre mesenkymale afstamninger: adipocytter, osteocytter og kondrocytter. Interessant nok kan MSC’er også differentiere sig til andre slægter såsom neuronale celler, kardiomyocytter, hepatocytter og epitelceller10,11.
Faktisk har MSC’er unikke egenskaber, der gør det muligt at anvende dem som potentielle terapeutiske midler i regenerativ terapi til forskellige sygdomme. MSC’er kan udskille opløselige faktorer for at inducere et immunmodulerende miljø, der giver terapeutiske fordele12. Derudover kan MSC’er migrere mod skadesteder og tumormikromiljøer for at levere målrettet terapi; Mekanismerne er dog ikke fuldt belyst13. Derudover har MSC’er evnen til at udskille exosomer, ekstracellulære vesikler i nanoskalaen, der bærer en last af ikke-kodende RNA’er, protein og opløselige faktorer, som for nylig opstod som en ny mekanisme for MSC’ernes terapeutiske potentiale i forskellige sygdomme14.
Endnu vigtigere har MSC’er skabt markant opmærksomhed for deres potentiale til at differentiere sig til insulinproducerende celler (IPC’er), enten ved genetisk modifikation15,16 eller ved at udnytte forskellige ekstrinsisk inducerende faktorer inden for kulturmediet in vitro17. IPC-induktionsperioden varierer meget, da det afhænger af den anvendte induktionsprotokol og de anvendte ydre faktorer. Differentieringsprocessen kan vare fra dage til måneder, og det kræver en kombination af eksogene inducerende faktorer, der skal tilføjes og / eller trækkes tilbage i forskellige faser. Mange af disse faktorer, der er blevet anvendt til endokrin bugspytkirteldifferentiering, er biologisk aktive forbindelser, der har vist sig at fremme proliferation eller differentiering / neogenese af insulinudskillende β-celler og / eller øge insulinindholdet i IPC’er 18,19,20,21. Det er her bemærkelsesværdigt, at MSC’er også er blevet rapporteret at have terapeutiske virkninger i diabetes og dets komplikationer via flere mekanismer, herunder deres sekretom, samt en bred vifte af immunmodulerende handlinger 22,23,24.
I denne protokol præsenterer vi en detaljeret trinvis protokol til isolering og karakterisering af Ad-MSC’er fra rotte epididymalt fedt efterfulgt af en simpel, relativt kort protokol til generering af IPC’er fra Ad-MSC’er.
I denne protokol lykkedes det os at præsentere en detaljeret protokol for isolering af Ad-MSC’er fra rotte epididymalt fedt og differentieringen af disse Ad-MSC’er til IPC’er. Faktisk er rotteepydydmalt fedt en let opnåelig kilde til fedtvæv til opnåelse af Ad-MSC’er og kræver ikke noget specielt udstyr, hverken til indsamling eller til behandling af 15,26,27. De isolerede Ad-MSC’er viste fremragende kulturudvidelse og udvi…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, Dyrlæge Specialist, Det Farmaceutiske Fakultet, The British University of Egypt (BUE) for at hjælpe med dissektion af rotterne.
Vi vil også gerne anerkende og værdsætte indsatsen fra Fakultetet for Massekommunikation, Det Britiske Universitet i Egypten (BUE) for produktion og redigering af videoen af dette manuskript.
Vi vil gerne takke Fatma Masoud, MSc, assisterende lektor i engelsk, The British University in Egypt (BUE) for revisionen og engelsksproget korrekturlæsning af manuskriptet.
Dette arbejde blev delvist finansieret af Center for Drug Research and Development (CDRD), Det Farmaceutiske Fakultet, Det Britiske Universitet i Egypten (BUE), Kairo, Egypten.
Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
DMEM – High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
DMEM – Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |