בידוד של תאי גזע מזנכימליים של רקמת שומן חולדה לצורך התמיינות לתאים המייצרים אינסולין
Summary
תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת השומן (Ad-MSCs) יכולים להיות מקור פוטנציאלי של MSCs המתמיינים לתאים המייצרים אינסולין (IPCs). בפרוטוקול זה, אנו מספקים שלבים מפורטים לבידוד ואפיון של Ad-MSCs אפידידימליים של חולדות, ולאחר מכן פרוטוקול פשוט וקצר ליצירת IPCs מאותם Ad-MSCs של חולדה.
Abstract
תאי גזע מזנכימליים (MSCs) – במיוחד אלה שבודדו מרקמת השומן (Ad-MSCs) – זכו לתשומת לב מיוחדת כמקור מתחדש ושופע של תאי גזע שאינם מהווים חששות אתיים כלשהם. עם זאת, השיטות הנוכחיות לבידוד Ad-MSCs אינן סטנדרטיות ומשתמשות בפרוטוקולים מסובכים הדורשים ציוד מיוחד. בודדנו את ה-Ad-MSCs מהשומן האפידידימלי של חולדות ספראג-דאולי בשיטה פשוטה הניתנת לשחזור. ה-Ad-MSCs המבודדים מופיעים בדרך כלל תוך 3 ימים לאחר הבידוד, שכן התאים הדבקים מציגים מורפולוגיה פיברובלסטית. תאים אלה מגיעים למפגש של 80% תוך שבוע מבידוד. לאחר מכן, במעבר 3-5 (P3-5), בוצע אפיון מלא עבור Ad-MSCs המבודדים על ידי אימונופנוטיפ עבור אשכול MSC אופייני של סמני פני שטח התמיינות (CD) כגון CD90, CD73 ו- CD105, כמו גם גרימת התמיינות של תאים אלה לאורך השושלות האוסטאוגניות, האדיפוגניות והכונדרוגניות. זה, בתורו, מרמז על multipotency של התאים המבודדים. יתר על כן, אנו גורמים להתמיינות של ה-Ad-MSCs המבודדים לעבר שושלת התאים המייצרים אינסולין (IPCs) באמצעות פרוטוקול פשוט וקצר יחסית על ידי שילוב של מדיום הנשר המהונדס של דולבקו עתיר גלוקוז (HG-DMEM), β-מרקפטואתנול, ניקוטינמיד ואקסנדין-4. התמיינות ה-IPCs הוערכה גנטית, ראשית, באמצעות מדידת רמות הביטוי של סמנים ספציפיים של תאי β כגון MafA, NKX6.1, Pdx-1 ו-Ins1, כמו גם צביעת דיתזון עבור ה-IPCs שנוצרו. שנית, ההערכה בוצעה גם באופן פונקציונלי על ידי בדיקת הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז (GSIS). לסיכום, ניתן לבודד בקלות Ad-MSCs, ולהציג את כל הקריטריונים לאפיון MSC, והם אכן יכולים לספק מקור שופע ומתחדש של IPCs במעבדה לחקר הסוכרת.
Introduction
תאי גזע מזנכימליים (MSCs), הידועים גם בשם תאים סטרומליים מזנכימליים, הם בין סוגי התאים הנפוצים ביותר לרפואה רגנרטיבית 1,2. הם מסווגים כתאי גזע בוגרים ומאופיינים בפוטנציאל התמיינות רב-קווית וביכולת התחדשות עצמית3. ניתן לבודד MSCs ולקבל ממקורות שונים, כולל רקמת שומן, מח עצם, דם היקפי, רקמת חבל הטבור ודם, זקיקי שיער ושיניים 4,5.
הבידוד של תאי גזע מרקמת השומן נתפס כמושך ומבטיח כאחד בשל גישתם הקלה, התפשטותם המהירה במבחנה ותפוקה גבוהה6. תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת השומן (Ad-MSCs) ניתנים לבודד ממינים שונים כגון בני אדם, בובינים, עכברים, חולדות, ולאחרונה גם עזים7. הוכח כי Ad-MSCs הם כעת מועמדים פוטנציאליים להנדסת רקמות ולטיפול גנטי/תאי שניתן אפילו להשתמש בהם כדי לפתח חלופה אוטולוגית לתיקון ארוך טווח של פגיעה ברקמות רכות או פגמים 7,8.
האגודה הבינלאומית לריפוי תאים וגנים (ISCT) הגדירה שלושה קריטריונים מינימליים שחייבים להיות מוצגים על ידי MSCs לאפיון מלא9. ראשית, הם חייבים להיות חסידי פלסטיק. שנית, MSCs צריכים לבטא סמני פני שטח של תאי גזע מזנכימליים כגון CD73, CD90 ו- CD105 וחוסר ביטוי של הסמנים ההמטופוייטיים CD45, CD34, CD14 או CD11b, CD79α או CD19 ו- HLA-DR. לבסוף, MSCs צריכים להפגין את היכולת להבדיל לשלוש שושלות מזנכימליות: אדיפוציטים, אוסטוציטים וכונדרוציטים. באופן מעניין, MSCs יכולים גם להתמיין לשושלות אחרות כגון תאים עצביים, קרדיומיוציטים, הפטוציטים ותאי אפיתל 10,11.
למעשה, ל-MSCs יש תכונות ייחודיות המאפשרות ליישם אותם כסוכנים טיפוליים פוטנציאליים בטיפול רגנרטיבי במחלות שונות. MSCs יכולים להפריש גורמים מסיסים כדי לגרום לסביבה אימונומודולטורית המספקת יתרונות טיפוליים12. בנוסף, MSCs יכולים לנדוד לעבר אתרים של פציעה ומיקרו-סביבה של גידולים כדי לספק טיפול ממוקד; עם זאת, המנגנונים אינם מובהרים במלואם13. בנוסף, ל-MSCs יש את היכולת להפריש אקסוזומים, שלפוחיות חוץ-תאיות בקנה מידה ננומטרי הנושאות מטען של רנ”א, חלבונים וגורמים מסיסים שאינם מקודדים, אשר התגלו לאחרונה כמנגנון חדשני של הפוטנציאל הטיפולי של ה-MSCs במחלות שונות14.
חשוב מכך, MSCs עוררו תשומת לב רבה לפוטנציאל שלהם להתמיין לתאים מייצרי אינסולין (IPCs), בין אם על ידי שינוי גנטי 15,16 או באמצעות שימוש בגורמים חיצוניים שונים הגורמים לתרבית במבחנה17. תקופת האינדוקציה של IPC משתנה מאוד, מכיוון שהיא תלויה בפרוטוקול האינדוקציה המשומש ובגורמים החיצוניים המנוצלים. תהליך הבידול יכול להימשך בין ימים לחודשים, והוא דורש שילוב של גורמים מעוררי אקסוגניות שיש להוסיף ו/או למשוך בשלבים שונים. רבים מהגורמים הללו ששימשו להתמיינות לבלב אנדוקרינית הם תרכובות פעילות ביולוגית שהוכחו כמקדמות את התפשטות או התמיינות/ניאוגנזה של תאי β מפרישי אינסולין ו/או מגדילות את תכולת האינסולין של IPCs 18,19,20,21. ראוי לציין כאן כי MSCs דווחו גם כבעלי השפעות טיפוליות בסוכרת ובסיבוכיה באמצעות מספר מנגנונים, כולל secretome שלהם, כמו גם מגוון רחב של פעולות ויסות חיסוני 22,23,24.
בפרוטוקול זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט של שלבים לבידוד ואפיון של Ad-MSCs משומן אפידידימלי של חולדות, ואחריו פרוטוקול פשוט וקצר יחסית ליצירת IPCs מ- Ad-MSCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, הצלחנו להציג פרוטוקול מפורט לבידוד של Ad-MSCs משומן אפידידימלי של חולדות ולהבחנה של Ad-MSCs אלה ל- IPCs. למעשה, שומן אפידידימלי של חולדות הוא מקור קל להשגה של רקמת שומן לקבלת Ad-MSCs ואינו דורש כל ציוד מיוחד, לא לאיסוף ולא לעיבוד 15,26,27. ה-Ad-…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר רודה סמיר מוחמד, MSc, מומחית לווטרינריה, הפקולטה לרוקחות, האוניברסיטה הבריטית של מצרים (BUE) על שסייעה בניתוח החולדות.
כמו כן, ברצוננו להודות ולהעריך את מאמציה של הפקולטה לתקשורת המונים, האוניברסיטה הבריטית במצרים (BUE) להפקה ועריכה של הסרטון של כתב יד זה.
ברצוננו להודות למיס פאטמה מסעוד, MSc, עוזרת מרצה לאנגלית, האוניברסיטה הבריטית במצרים (BUE) על התיקון וההגהה בשפה האנגלית של כתב היד.
עבודה זו מומנה בחלקה על ידי המרכז למחקר ופיתוח תרופות (CDRD), הפקולטה לרוקחות, האוניברסיטה הבריטית במצרים (BUE), קהיר, מצרים.
Materials
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM – High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM – Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
Referências
- Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).
- Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. , 1-28 (2022).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user’s guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).
- Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
- Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
- Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).
- Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).
- Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
- Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
- Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton’s jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339 (2018).
- Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108 (2016).
- Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
- Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
- Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).
- Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of flow cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , 1-12 (2010).
- Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
- Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277 (2021).
- Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 8 (2), 2652 (2020).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
- Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).
- Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).
- Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484 (2020).
- El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton’s jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
- El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
- Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).
